m6A去甲基化酶FTO在砷诱发多巴胺能神经传导障碍中的调控作用

发布时间：2020-09-21 13:49

　　 第一部分慢性饮水砷暴露对小鼠皮层多巴胺能神经传导的影响目的:通过建立慢性饮水砷暴露动物模型,观察砷对小鼠神经行为功能、皮层组织形态和超微结构及多巴胺能神经传导过程关键蛋白的影响,为揭示砷诱发皮层多巴胺能神经传导障碍提供理论依据。方法:,将64只7周雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白组、砷低剂量组(0.5 mg/L)、砷中剂量组(5 mg/L)、砷高剂量组(50 mg/L);每组16只,饮水砷暴露6个月。染毒结束后,采用Morris水迷宫评价小鼠的空间学习记忆能力,八臂迷宫评价小鼠工作和参考记忆能力、穿梭箱评价小鼠条件反射和非条件反射能力,旷场实验评价小鼠的自主行为活动;应用原子荧光光谱和高效液相色谱分别检测皮层中砷及多巴胺的含量;尼氏染色和透射电子显微镜分别观察皮层组织神经元形态及突触超微结构变化;采用Western-blot检测皮层多巴胺能神经传导过程中酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(DAT)、分解酶(COMT)、多巴胺受体(DRD)蛋白的表达水平。结果:(1)慢性饮水砷暴露6个月后,对照组与砷暴露组小鼠体重无明显差异(P0.05)。(2)与对照组相比:(1)Morris水迷宫结果显示,砷暴露组小鼠游泳距离和逃避潜伏期增加(P0.05),跨平台次数及目标象限停留时间减少(P0.05),而两组之间的游泳速度无明显差异(P0.05);(2)八臂迷宫结果显示,砷暴露组小鼠的正确潜伏期、总进臂次数、测试时间、参考记忆错误次数、工作记忆错误次数均增加(P0.05);(3)穿梭箱结果显示,砷暴露组小鼠的主动和被动回避时间、被动逃避次数均随着砷暴露剂量而增加(P0.05),而主动回避次数明显降低(P0.05);(4)旷场实验结果显示,砷暴露组小鼠的粪便数明显增多(P0.05),中央区域活动总路程和活动时间明显减少(P0.05),而中央区域活动次数无明显差异(P0.05)。(3)原子荧光光谱和高效液相色谱结果显示,随着砷染毒剂量的增加,皮层组织中砷含量增加,而多巴胺浓度减少(P0.05)。(4)尼氏染色结果显示,随着砷暴露剂量的增加尼氏小体数量减少且尼氏小体显示空泡变性,边缘模糊,染色变浅;透射电子显微镜结果显示,砷暴露组的突触后致密物厚度显著大于对照组(P0.05),但突触活性区域长度、突触间隙宽度与对照组相比无明显差异(P0.05)。(5)与对照组相比,饮水砷暴露6个月后,多巴胺能神经传导过程中的TH、DAT、COMT、DRD1、DRD2、DRD4、DRD5蛋白表达均明显降低(P0.05),DRD3无明显改变(P0.05)。结论:慢性饮水砷暴露影响了多巴胺的合成、转运、分解、结合过程,导致小鼠皮层多巴胺含量降低,且伴随神经元损伤和突触超微结构异常,从而诱发一系列的神经行为功能障碍。第二部分FTO在砷诱发的多巴胺能神经传导障碍中的作用目的:通过细胞模型验证砷暴露能否诱发多巴胺能神经传导障碍,深入探讨FTO在砷诱发多巴胺能神经传导障碍中的作用,从而为靶向调控FTO基因预防或干预砷致神经退行性疾病提供实验依据。方法:采用CCK-8法检测砷染毒对PC-12细胞活性的影响;高效液相法检测砷染毒后PC-12细胞内多巴胺浓度,Western-blot检测砷染毒后PC-12细胞中TH、DAT、COMT蛋白的表达;采用斑点杂交和免疫荧光技术检测皮层组织及PC-12细胞内m6A的修饰水平;Western-blot检测组织和细胞内FTO的蛋白表达水平,免疫荧光观察FTO与TH的共定位情况;最后借助siRNA和CRISPRa转染技术建立FTO敲低、过表达细胞模型,并检测m6A修饰水平及多巴胺传导通路关键蛋白的改变。结果:(1)砷染毒24 h后,PC-12细胞活性显著降低,且呈明显的剂量-反应关系。(2)高效液相色谱结果显示,砷染毒后PC-12细胞中多巴胺浓度降低(P0.05),且细胞内TH、DAT、COMT随着染毒剂量的增加而显著下降(P0.05),与动物模型中趋势一致。(3)斑点杂交和免疫荧光结果显示,与对照组相比,砷暴露后皮层组织及PC-12细胞中m6A修饰水平明显增加。(4)与对照组相比,砷暴露后皮层组织和PC-12细胞中FTO蛋白表达水平显著降低(P0.05),且FTO与TH存在共定位。(5)下调FTO表达,砷暴露组m6A修饰水平较对照组增加更明显,且砷处理组的TH、DAT、COMT的蛋白表达水平明显降低(P0.05);反之,上调FTO表达,m6A的修饰水平降低,且FTO CRISPRa与砷双重暴露组的TH、DAT、COMT蛋白表达较单独砷暴露组有增加的趋势(P0.05)。结论:砷暴露导致PC-12细胞活性降低,m6A修饰水平增加,FTO蛋白表达减少;通过下调和上调FTO表达,多巴胺能传导通路中的关键蛋白发生改变,提示m6A去甲基化酶FTO可能对砷所致的多巴胺能神经传导障碍具有调控作用。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R114
【部分图文】：

图 1 砷暴露对小鼠体重的影响 (mean±SD,n=64)注：* P < 0.05Figure.1 Effect of arsenite exposure on body weight of mice (mean±SD,n=Note：*P < 0.05性饮水砷暴露对小鼠神经行为功能的影响迷宫实验结果据表明，经过 4 天的定位航行试验，各组小鼠的逃避潜伏期均明.05）（图 2B）；此外，训练的第 3 天和第 4 天，砷暴露组小鼠逃避于对照组（P<0.05）（图 2B）。图 2A 所示，训练的第 3 天和第 高剂量处理组小鼠的游泳距离比空白组明显增加，差异具有统计.05）。各组之间游泳速度没有明显差异（图 2C），表明砷暴露对小可能没有影响。空间探索试验数据显示（训练的第 5 天），中剂量

28图 2 砷暴露对小鼠空间学习记忆能力的影响A 游泳路程; B 逃避潜伏期; C 游泳速度; D 目标象限停留时间E 跨平台次数; F 游泳轨迹图注：* P < 0.05Figure.2 Effects of arsenite exposure on spatial learning and memory in miceAswim distance; B Escape latency; C speed; D Time speed in target quanrantE Number of cross platform; F Representative track maps

重庆医科大学硕士研究生学位论文Note：*P < 0.05.2.2 八臂迷宫实验结果图 3A 显示，与对照组相比，各砷暴露组小鼠的正确潜伏期与染毒剂量呈明剂量-反应关系（P<0.05）；图 3B 中可以看出，5 mg/L 和 50 mg/L 砷处理组的总进臂次数多于对照组（P<0.05）；图 3C 显示，仅高剂量组小鼠测试时间对照组（P<0.05）；图 3D 显示，中剂量和高剂量小鼠的参考记忆错误次数有的增加（P<0.05），且工作记忆错误次数随着染毒剂量的增加而增加（P<0.05现出明显的剂量反应关系（图 3E）。以上实验结果表明，慢性饮水砷暴露可导致小鼠的工作和参考记忆缺陷，学习能力减弱。

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本文编号：2823563