纳米碳黑与重金属联合染毒对BEAS-2B细胞的联合毒性作用模式与机制研究

发布时间：2017-04-03 06:15

  本文关键词：纳米碳黑与重金属联合染毒对BEAS-2B细胞的联合毒性作用模式与机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：空气颗粒物(Particulate Matter, PM)是危害我国居民健康的主要环境因素之一,其健康效应及潜在毒性机制越来越受到人们关注。研究表明,不同地区、不同季节的PM组分差异较大,往往造成毒理学研究结果的可比性较低,难以充分了解PM的毒性效应及潜在机制。目前,对于PM毒性效应研究多是针对PM整体或针对其单一组分(如金属或有机成分等),很少考虑主要组分间的联合毒性作用。而选择PM中代表性组分进行联合毒性的研究,对于阐明PM的毒性作用特征、比较不同颗粒物的毒性差异和开展PM健康危害评估具有重要的理论意义和应用价值。因此,本研究通过对PM中代表性组分纳米碳黑(NPCB)和重金属(Pb/Cr/Cd)对BEAS-2B细胞的联合毒性效应研究,旨在阐明PM主成分的联合毒性作用模式,为PM的风险评估提供实验依据。方法：本课题第一部分主要探讨了NPCB和重金属(Pb/Cr/Cd)对BEAS-2B细胞的联合毒性作用模式,主要指标包括基本细胞毒性、氧化损伤、周期和凋亡。采用细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)和乳酸脱氢酶试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)检测纳米碳黑(NPCB)和重金属(Pb/Cr/Cd)联合染毒24h对BEAS-2B细胞存活率和LDH漏出率的影响；采用DCFH-DA探针对NPCB和重金属(Pb/Cr/Cd)联合染毒3h后BEAS-2B的ROS水平进行检测,采用总抗氧化能力试剂盒和SOD活性检测试剂盒检测NPCB和重金属(Pb/Cr/Cd)联合染毒24h后的细胞抗氧化能力,采用单细胞凝胶电泳技术检测联合染毒24h的细胞DNA损伤程度,采用流式细胞术(PI染色)检测联合染毒24h的细胞周期改变,采用Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒检测NPCB和重金属(Pb/Cr/Cd)联合染毒24h的细胞凋亡率。本课题第二部分对DNA损伤修复通路在NPCB与重金属联合染毒致DNA损伤中的作用机制进行了初步研究。采用Western Blot检测NPCB与三种重金属联合染毒对细胞DNA损伤修复相关蛋白ATM、p-p53/p53和yH2AX表达的影响。结果与讨论：基本细胞毒性的研究结果显示,NPCB与重金属(Pb/Cr/Cd)联合染毒在细胞存活率和LDH漏出方面存在联合作用,但联合作用模式随金属不同、剂量不同以及评价指标不同而不同。低剂量Pb与NPCB联合作用对细胞存活率无交互作用,对细胞LDH漏出率表现为拮抗作用,高剂量Pb与NPCB联合染毒对细胞存活率表现为协同作用,对细胞LDH漏出率则无明显交互作用；Cd、Cr与NPCB联合染毒在细胞存活率方面均表现为协同作用,低剂量Cd和Cr与NPCB对细胞LDH漏出率不存在联合作用,高剂量时均表现为协同作用。ROS检测结果显示联合染毒明显促进了ROS的生成；细胞总抗氧化能力和SOD活性检测结果显示,NPCB与三种重金属联合染毒在细胞总抗氧化能力和SOD活性方面存在联合作用,Pb和Cr与NPCB联合作用对总抗氧化能力表现为协同作用,Cd与NPCB联合作用在总抗氧化能力上无明显联合作用；Cd和Cr与NPCB联合作用对SOD表现为协同作用,Pb与NPCB联合作用在SOD上无明显联合作用；单细胞凝胶电泳结果显示,三种重金属与NPCB联合染毒均明显增强了细胞DNA损伤程度,方差分析结果显示联合作用模式为协同作用；在细胞周期阻滞和细胞凋亡方面,三种重金属与NPCB均无明显联合作用。Western Blot检测结果显示,与对照组和金属单独作用组相比,三种重金属与NPCB联合作用对这三种蛋白的表达均产生了不同程度的影响,提不ATM-p53-H2AX这条DNA损伤修复通路很可能在NPCB与重金属的联合染毒中发挥重要作用,然而其具体机制还需研究证实。结论：NPCB与重金属对BEAS-2B细胞存在联合毒性作用,可以通过诱导细胞产生大量ROS、降低细胞抗氧化防御能力引起细胞氧化损伤,尤其是DNA氧化损伤。联合作用模式分析结果显示,不同金属与NPCB的联合作用模式随金属不同、剂量不同以及评价指标不同而不同。此外,DNA损伤修复通路可能在联合染毒引起的细胞DNA损伤中发挥重要作用,具体机制有待进一步研究证实。
【关键词】：纳米碳黑 重金属 铅 铬 镉 联合毒性
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 个人简历3-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-16
• 第一部分 NPCB与重金属Pb/Cd/Cr联合染毒对BEAS-2B细胞的联合毒性作用模式研究16-58
• 材料与方法16-33
• 1 实验材料16-18
• 1.1 细胞系16
• 1.2 主要试剂16-17
• 1.3 特殊耗材17
• 1.4 主要仪器17-18
• 2 实验方法18-31
• 2.1 纳米粒度分析仪测NPCB粒度分布18
• 2.2 透射电镜(TEM)检测NPCB表征18
• 2.3 细胞复苏与培养18-19
• 2.4 染毒液配制与染毒剂量分组19-20
• 2.5 CCK-8法测细胞存活率20
• 2.6 HE染色观察细胞形态20-22
• 2.7 LDH法测乳酸脱氢酶漏出率22
• 2.8 细胞内活性氧(ROS)检测22-23
• 2.9 细胞总抗氧化能力检测23-24
• 2.10 细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性检测24-26
• 2.11 单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA损伤26-29
• 2.12 PI染色流式细胞术检测细胞周期29-30
• 2.12.1 实验原理29-30
• 2.12.2 实验步骤30
• 2.13 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡30-31
• 2.13.1 实验原理30-31
• 2.13.2 实验步骤31
• 3 统计学分析31-33
• 实验结果33-53
• 1 NPCB分散液的筛选结果33-35
• 1.1 不同超声时间及分散介质对NPCB粒径分布的影响33
• 1.2 不同分散液粒径分布结果33-34
• 1.3 透射电镜观察结果34-35
• 2 NPCB与重金属单独及联合染毒24h对细胞存活率的影响35-38
• 2.1 NPCB、PbAc、CdCl_2、K_2Cr_2O_4单独染毒24h对细胞存活率的影响35-36
• 2.2 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞存活率的影响36-38
• 3 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞形态学影响38-39
• 4 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞LDH漏出的影响39-41
• 5 NPCB与重金属联合染毒3h对细胞ROS生成的影响41-42
• 6 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞总抗氧化能力的影响42-44
• 7 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞SOD活性的影响44-45
• 8 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞DNA损伤的影响45-48
• 9 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞周期的影响48-51
• 10 NPCB与重金属联合染毒24h对细胞凋亡率的影响51-53
• 讨论53-57
• 小结57-58
• 第二部分 DNA损伤修复通路在NPCB与重金属联合染毒致DNA损伤中的作用机制研究58-72
• 材料与方法58-65
• 1 实验材料58-59
• 1.1 细胞系58
• 1.2 主要试剂及特殊耗材58-59
• 1.3 主要仪器59
• 2 实验方法59-64
• 2.1 蛋白的提取与定量(BCA法)59-60
• 2.2 Western Blot法检测蛋白表达60-64
• 3 统计学分析64-65
• 实验结果65-68
• 1 NPCB与PbAc联合染毒对细胞DNA损伤修复相关蛋白表达的影响65-66
• 2 NPCB与Cdcl_2联合染毒对细胞DNA损伤修复相关蛋白表达的影响66-67
• 3 NPCB与K_2Cr_2O_4联合染毒对细胞DNA损伤修复相关蛋白表达的影响67-68
• 讨论68-71
• 小结71-72
• 结论72-73
• 参考文献73-79
• 英文缩略词表79-80
• 综述80-93
• 参考文献87-93
• 致谢93-95
• 附件 论文发表情况95-105

【参考文献】

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1 赵曼;DNA损伤修复通路在细胞应对银纳米颗粒刺激中作用的研究[D];湖南大学;2012年

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本文编号：283863