多溴联苯醌诱导BV2细胞自噬、内质网应激和DNA损伤毒性的机制分析

发布时间：2021-01-21 10:11

　　多溴联苯醚（PBDEs）作为一种阻燃剂被广泛应用于商业和家庭用品等各个领域。然而,PBDEs化学性质稳定、不易降解、且具有生物蓄积性,能够长期存在于环境和生物体中,对人类生存环境和生命健康造成极大的威胁。在生物体内,PBDEs可能发生生物转化,产生相应的羟基代谢物（OH-PBDEs）,进一步还可氧化生成多溴联苯醌（PBDEQ）,这些代谢物与母体相比具有相似或更高的毒性。多溴联苯醌（PBDEQ）作为PBDEs的醌类代谢产物,在生物体内很容易与DNA、蛋白质、亲核试剂发生迈克尔加成反应。此外,PBDEQ在与对苯二酚-半醌-醌的氧化还原过程中还能产生半醌自由基或活性氧（ROS）,引起氧化应激反应,进一步诱导细胞毒性,对生物体造成神经毒性、免疫毒性、生殖毒性以及致癌等作用。第一部分:该部分旨在研究PBDEQ能诱导小胶质细胞（BV2）发生细胞自噬。首先,我们检测了PBDEQ在不同浓度和不同时间作用下的细胞毒性,通过CCK-8实验发现PBDEQ引起BV2细胞存活率呈浓度和时间依赖性降低。接着,我们考察了PBDEQ是否能够引起细胞自噬。利用Western Blot实验检测了细胞自噬相关蛋白LC3B、... 

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4-二溴联苯醌结构式

西南大学硕士学位论文18活率<80%）的给药浓度（10μM）、作用时间（24h）来进行后续实验。图2-1PBDEQ对BV2细胞存活率的影响Fig.2-1EffectofPBDEQonBV2cellviability2.4.2PBDEQ在BV2细胞中诱导自噬发生为了考察PBDEQ能否诱导BV2细胞自噬活性增强，我们检测了能够反映自噬发生的相关指标。在自噬过程中，非激活型胞质LC3B-I经过水解和脂质化转化成膜结合形式的LC3B-II，并由最初的分散分布转而定位于新形成的自噬体的内膜和外膜上，所以LC3B通常被视作细胞发生自噬的标志性蛋白85。p62/SQSTM1是一种由应激诱导产生并作用于选择性自噬的多功能蛋白，且p62包含多种蛋白作用域，可结合聚泛素化蛋白并将其进一步降解，在信号转导过程中发挥重要作用86。LC3B和p62的表达可以反映自噬的强弱。LC3B-II上调，p62下调，表明自噬流通畅；而LC3B-II上调，p62也上调，表明自噬起始正常，但下游通路被阻断，自噬体和溶酶体不能融合。如图2-2（a）所示，通过WesternBlot实验检测PBDEQ处理细胞后LC3B、p62的表达水平，结果显示LC3B-II的转化随着给药浓度增加而上调，p62则呈下调趋势。同时，如图2-2（b），通过免疫荧光实验观察LC3B荧光斑点的表达，发现与对照组相比，PBDEQ处理组细胞质中出现明显的绿色荧光斑点。初步证明PBDEQ诱导BV2细胞发生自噬现象。接下来，为了进一步确自噬现象的发生，我们使用了荧光染料对自噬体进行标记。MDC、AO染色法是常用的酸性细胞器标记技术。MDC是一种嗜酸性染色剂，可与酸性细胞器（自噬溶酶体）结合呈现绿色荧光。AO能透过细胞膜并嵌入细胞核与DNA结合，发出绿色荧光，也可以进入酸性细胞器如自噬溶酶体，pH降低时，AO发出红色荧光。因此，通过观察荧光强度即可反映出自噬体形成情况。如图2-2（c），随

第二章PBDEQ诱导BV2细胞发生自噬19MDC绿色荧光增强，也表明了自噬体形成的增加。图2-2（d）中，随着PBDEQ给药浓度增加，与对照组相比，PBDEQ组细胞内AO红色荧光强度增强，说明自噬体形成增多。综上，PBDEQ能够诱导BV2细胞自噬活性增强。图2-2PBDEQ诱导BV2细胞自噬的发生。（a）PBDEQ以浓度（0、5、10μM）处理BV2细胞24h后，WesternBlot实验检测LC3B，p62蛋白表达情况。（b）免疫荧光实验检测PBDEQ处理BV2细胞后细胞内LC3B表达情况（标尺棒为10μm）。（c）MDC染色法检测PBDEQ暴露后细胞内自噬体形成情况。（d）AO染色法检测PBDEQ暴露后细胞内自噬体形成情况（标尺棒为10μm）。所有数据均以三组独立实验的均数±标准差表示。两组间比较采用t检验（p＜0.05表示两组间比较有显著性差异）。Fig.2-2PBDEQinducedautophagyinBV2cells.(a)TotalproteinswereextractedfromBV2cellsaftertreatingwithPBDEQfor24h,andweresubjectedtoanalysistheLC3Bandp62expressionbywesternblot.(b)ImmunofluorescencestainingforendogenousLC3Bpunctaformation(green)usedtodetectautophagyaftertreatingwithPBDEQ(10μM)for24hinBV2cells.CellnucleiwerecountertainedwithDAPI(blue)(scalebars:10μm).(c)CellswereexposedtoPBDEQfor24hforMDCstaining.Thedatawereobtainedbyflowcytometry.(d)AOstainingdetectedtheformationofautolysosome(red)withexposuretoPBDEQfor24hinBV2cells.Theimageswerecapturedbyfluorescencemicroscopyatthemagnifcationof200×(scalebars:10μm).Alldatawereexpressedasmeans±SDofthreeindependentexperiments.P-valueswerecalculatedbyt-testandcomparedwithcontrolgroup.

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：2990967