可视化抗体宏阵列技术对肠出血性大肠杆菌O157:H7及鲍氏志贺氏菌的同步定量检测研究

发布时间：2017-04-14 02:20

  本文关键词：可视化抗体宏阵列技术对肠出血性大肠杆菌O157:H7及鲍氏志贺氏菌的同步定量检测研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着国家《食品中致病菌限量》标准的颁布，我国食源性致病菌的检测将从原来的零检出变成部分生鲜食物原料限量检出，这也对目前快速检测领域提出了新要求，现行国标方法的定量检测均为平板计数，相对较为耗时费力，本研究旨在探索一种基于蛋白质芯片的高通量快速定量检测方法，为食源性致病菌检测提供一条新思路。 本研究以免疫学中“双抗体夹心”法原理为基础，基于可视化抗体宏阵列技术，对肠出血性大肠杆菌O157:H7和鲍氏志贺氏菌完成同步快速定量检测。 以微孔性质的硝酸纤维素膜为载体基片，整个实验过程均在此基片上完成。将目标细菌的特异性抗体以喷点的方式固定在基片表面，组成抗体阵列，用于检测样品中的目标细菌，，再加入HRP标记过的另一种特异性抗体，最后通过化学显色方法确定实验结果。之后通过成像、分析检测点灰度值，制作标准曲线，推算样品中致病菌的含量。 结果显示，可视化抗体宏阵列对肠出血性大肠杆菌O157:H7和鲍氏志贺氏菌有很好的特异性识别作用，对这两种细菌的检测灵敏度分别达到了3.4×105CFU/mL和3.2×105CFU/mL，两者相应的标准曲线拟合的也较为理想，三次平行实验的结果之间的变异系数远小于一般ELISA实验所要求的10%，充分说明了标准曲线的稳定性和重现性。双检模拟增菌定量检测的结果显示，只有一个标准曲线推算结果与平板计数结果相差一个数量级，其余标准曲线推算的结果均与平板计数结果在同一数量级之上，从而论证了本研究的可行性。之后与传统的ELISA以及PCR方法进行比较，在灵敏度上三者均一致，相比于后两者，本研究耗时仅为2.5h，同时可实现定量检测，在食源性致病菌快速定量检测上取得了一定进展。
【关键词】：可视化 抗体宏阵列 食源性致病菌 定量检测 蛋白质芯片
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要2-3
• ABSTRACT3-8
• 文献综述8-16
• 1. 前言16-17
• 2. 材料与方法17-25
• 2.1 主要材料与试剂17-18
• 2.2 主要仪器设备18-19
• 2.3 实验方法19-25
• 2.3.1 标准菌悬液的制备19
• 2.3.2 O157Mab 与 SHBMab 的 HRP 标记19-20
• 2.3.3 可视化抗体宏阵列的构建20-21
• 2.3.4 抗体宏阵列的“双抗体夹心”法检测21
• 2.3.5 O157Pab 与 SHBPab 最佳点样浓度的选择21-22
• 2.3.6 硝酸纤维素膜的选择22
• 2.3.7 O157 抗体宏阵列的构建22-23
• 2.3.8 SHB 抗体宏阵列的构建23
• 2.3.9 O157 与 SHB 双检抗体宏阵列的构建23-25
• 3. 结果与分析25-47
• 3.1 结果25-44
• 3.1.1 标准菌悬液的制备25
• 3.1.2 两种 HRP 标记的单克隆抗体效价检测结果25-26
• 3.1.3 两种捕获抗体最佳浓度的选择26-27
• 3.1.4 抗体宏阵列基片的选择27-28
• 3.1.5 肠出血性大肠杆菌 O157:H7 抗体宏阵列的构建28-34
• 3.1.6 鲍氏志贺氏菌抗体宏阵列的构建34-39
• 3.1.7 肠出血性大肠杆菌 O157:H7 与鲍氏志贺氏菌的同步检测39-44
• 3.2 两种传统快速检测方法对 O157 和 SHB 的灵敏度44-45
• 3.2.1 PCR 方法对 O157 和 SHB 的检测灵敏度44-45
• 3.2.2 ELISA 方法对 O157 和 SHB 的检测灵敏度45
• 3.3 分析45-47
• 3.3.1 抗体宏阵列基片的选择45
• 3.3.2 标准曲线的拟合45-46
• 3.3.3 模拟增菌定量检测46-47
• 4. 讨论47-49
• 4.1 实验部分47-48
• 4.2 小结48-49
• 5. 结论49-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-56
• 作者简介56-57
• 导师简介57-58

【参考文献】

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本文编号：305007