BMSCs抑制矽肺大鼠肺泡巨噬细胞自噬活化的体外研究

发布时间：2017-04-18 07:26

  本文关键词：BMSCs抑制矽肺大鼠肺泡巨噬细胞自噬活化的体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的通过体内染尘制备大鼠矽肺模型和体外细胞培养实验，探讨：1.在大鼠矽肺的发生过程中AM内是否存在自噬的激活；2. BMSCs移植对AM自噬的调控影响；3. BMSCs对AM自噬的调控与PI3K-AKT-mTOR-P70S6K信号通路的关系。 方法1.动物分组及模型制备：90只SPF级雄性SD大鼠（体质量180~220g）随机分为三组：模型对照组（control group）、矽肺模型组（model group）、BMSCs治疗组（BMSCs treatment group）；5只SPF级雄性SD大鼠（3~5周龄，体质量100~120g）用于BMSCs分离及培养。采用非暴露式一次性气管灌注法制备大鼠矽肺模型，一次性灌注灭菌氯化钠溶液与SiO2粉尘混悬液（50mg/ml）1.0ml；模型对照组灌注灭菌氯化钠溶液1.0ml；BMSCs治疗组于造模24h后经尾静脉注入BMSCs混悬液1.0ml，约3×106个细胞。2.检测指标及方法：①BMSCs的鉴定：流式细胞仪检测BMSCs表面标记物CD29，CD45，CD54，CD106的表达；②一般形态学观察：苏木素-伊红（HE）染色观察AM形态；③免疫细胞化学染色法检测LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的表达及分布；④免疫印迹法检测LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的蛋白表达量；⑤透射电镜观察自噬体的形成。3.定量测定及统计学分析：免疫细胞化学阳性细胞阳性度强弱用Image-ProPlus6.0数码医学图像分析系统半定量分析测定，以积分光密度值（IOD值）来表示。蛋白定量用Image J医学图像分析系统对PVDF膜上蛋白特异表达条带进行半定量分析，得出平均光密度值（OD值），最后以目标OD值比内参（β-actin）OD值的比值作为分析对象进行比较。实验中所得数据用Excel建库，均用均值±标准差（x±s）表示，用SPSS16.0统计软件进行完全随机设计的单因素方差分析，两组间比较用qq检验，以P0.05表示差异有统计学意义。 结果1. BMSCs的形态学观察结果：BMSCs原代细胞胞体小，基本为均匀梭形或圆形，核居中，偶有宽大扁平的多边形细胞，细胞折光性强，以分散的克隆聚集方式增殖。10d后原代细胞95％融合，此时进行传代，细胞传至第三代，形态更为均一，呈梭形成纤维细胞样。2. BMSCs表面标记物表达的鉴定结果：结果显示细胞CD29、CD106抗体阳性表达率分别为75.04％、75.49％，为阳性表达，CD45、CD54抗体阳性表达率分别为4.07％、4.85％，为阴性表达。3. AM的形态学观察结果：HE染色结果显示模型对照组AM圆形或椭圆形，结构清晰，轮廓清楚，形态均一，未见矽尘吞噬颗粒。与模型对照组相比，矽肺模型组AM体积增大，圆形、椭圆形或不规则形，形态不均一，细胞轮廓不清，部分细胞可看到毛刺样突起，细胞核位于细胞中央或一侧，胞质更加疏松丰富，部分细胞胞质内可见吞噬的矽尘颗粒。BMSCs治疗组与矽肺模型组相比，AM受损程度有所减轻，细胞形态不均一。4.免疫细胞化学染色结果：模型对照组LC-3，Beclin-1仅有微弱表达，呈现淡棕黄色。与模型对照组相比，矽肺模型组在各时间点的阳性表达均增强（P0.05），并且其表达变化呈现出时间依赖性变化趋势，随着时间延长，表达强度逐渐增加，其表达至14d时达高峰（P0.05），28d时有所降低，但仍高于模型对照组的表达（P0.05）。与矽肺模型组相比，BMSCs治疗组在各时间点的表达均减弱（P0.05），但表达趋势未变。模型对照组mTOR，P70S6K蛋白有一定量表达，呈现棕褐色。与模型对照组相比，矽肺模型组在各时间点的阳性表达均减弱（P0.05），并且其表达变化呈现出时间依赖性变化趋势，随着时间延长，表达强度逐渐降低，其14d时表达至低峰（P0.05），28d时有所回升，但仍低于模型对照组的表达（P0.05）。与矽肺模型组相比，BMSCs治疗组在各时间点的表达均增强（P0.05），但表达趋势未变。5. Western blot检测结果：在模型对照组LC-3，Beclin-1蛋白仅有微量基础表达，，且各时间点间表达无明显变化。矽肺模型组和BMSCs治疗组LC-3，Beclin-1动态表达与免疫细胞化学检测结果相吻合。在模型对照组mTOR，P70S6K蛋白有一定量的基础表达，且各时间点间表达无明显变化。矽肺模型组和BMSCs治疗组mTOR，P70S6K动态表达与免疫细胞化学检测结果相吻合。6.透射电镜结果：模型对照组AM胞质内细胞器丰富，完整，细胞基质均匀一致，溶酶体丰富，线粒体结构完整，核仁清晰，核膜完整、连续，核染色质分布正常。矽肺模型组AM胞质内可见SiO2吞噬颗粒，在细胞核周围，线粒体附近，有双层膜包被的圆形或椭圆形自噬体形成，可见双层膜结构的自噬前体，呈新月形或杯状。 结论1.在大鼠矽肺的发生发展过程中AM内存在自噬的激活，AM自噬参与了矽肺的病理进程；2. BMSCs移植可以抑制AM内自噬的过度激活；3. BMSCs通过调控PI3K-AKT-mTOR-P70S6K信号通路，最终抑制AM自噬。
【关键词】：矽肺 骨髓间充质干细胞 肺泡巨噬细胞 自噬 LC-3 Beclin-1 mTOR P70S6K
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R135.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第1章 实验研究14-52
• 1.1 材料与方法14-26
• 1.1.1 实验材料14-19
• 1.1.2 实验方法19-25
• 1.1.3 结果判定及统计学处理25-26
• 1.2 结果26-43
• 1.2.1 BMSCs 的形态学观察26-27
• 1.2.2 BMSCs 表面标记物表达的鉴定结果27-28
• 1.2.3 AM 的形态学观察28-29
• 1.2.4 免疫细胞化学染色结果29-35
• 1.2.5 Western blot 检测结果35-42
• 1.2.6 透射电镜检测结果42-43
• 1.3 讨论43-47
• 1.3.1 AM 在矽肺纤维化中的作用43-45
• 1.3.2 AM 自噬参与矽肺的病理进程45-46
• 1.3.3 BMSCs 通过激活 mTOR 通路进而抑制 AM 自噬46-47
• 1.4 结论47
• 参考文献47-52
• 第2章 综述52-66
• 2.1 自噬的发生机制52-54
• 2.2 自噬与炎症及免疫应答的相互作用54-56
• 2.2.1 自噬与炎性信号54-55
• 2.2.2 自噬与适应性免疫应答55-56
• 2.3 自噬在炎性疾病中的作用56-58
• 2.3.1 自噬在克罗恩病疾病中的作用56-57
• 2.3.2 自噬在呼吸道感染中的作用57-58
• 2.3.3 自噬在败血症中的作用58
• 2.4 自噬在肺疾病中的作用58-60
• 2.4.1 自噬相关蛋白 LC3B 在肺性高血压中的作用58-59
• 2.4.2 自噬在囊性纤维化中的作用59-60
• 2.5 结语60
• 参考文献60-66
• 致谢66-67
• 导师简介67-68
• 作者简介68-69
• 学位论文数据集69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 高俊玲,田艳霞,崔建忠,张宇新,孙树勋;矽尘致肺泡巨噬细胞氧化损伤的超微结构和细胞化学研究[J];解剖学杂志;2000年02期

2 徐萍;王s

本文编号：314334