重组Lac Z酵母细胞构建及对化学诱变原的高通量筛选研究

发布时间：2017-04-26 03:05

  本文关键词：重组Lac Z酵母细胞构建及对化学诱变原的高通量筛选研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基因毒性(Genotoxic)是指能直接或间接损伤细胞DNA的性质。诱变原即具有基因毒性作用的化合物,它能够改变机体细胞遗传物质而诱发突变。当今,化学诱变原已成为危害环境和人类健康的一大类因素,防止这类化学污染物对环境污染成为人类预防癌症的重要手段之一。目前,人们已经提出多种对致突变化学诱变原毒性评价的试验方法,如Ames试验、微核和染色体试验等。随着科学技术的发展,一些常规的评价检测方法的缺点逐渐突显出来：敏感度低,耗时较长,操作繁琐以及成本过高等方面成为了影响对化学诱变原毒性评价的因素。本课题利用生物传感器技术,与其中的微生物传感器技术相结合,用重组的酵母细胞作为宿主细胞,用Lac Z作用为报告基因,利用经化学诱变原作用后表达产物可催化底物显色这一特性,特性作为信号转换的标识,评价致突变化学物的毒性作用强度。化学诱变物主要分为两类：直接化学诱变物和间接化学诱变物,前者对DNA具有直接损伤作用,后者自身对DNA无损伤作用,但其进入机体内可经某些反应转化为具有基因毒性作用的物质。本课题利用构建重组酵母细胞分别对直接和间接化学诱变物进行高通量筛选研究。1.重组酵母细胞W303-1A/RNR3-LacZ的构建及对直接诱变物的筛选目的：建立由RNR3调控重组Lac Z基因酵母细胞以筛选直接化学诱变物。方法：利用PCR方法从酵母基因组中扩增RNR3启动子,将其插入到pMP206/ERE酵母报告载体,构建成RNR3调控的Lac Z酵母报告载体,将该载体转入W303-1A酵母细胞,构建成RNR3调控的重组Lac Z基因酵母细胞。用数种化学诱变原作用于该重组基因酵母细胞,观察其对RNR3的诱导表达,用Excel软件进行分析。结果：放线菌素D、丝裂霉素C、阿非迪霉素和溴乙锭不能诱导RNR3的表达,而甲磺酸甲脂、瘤可宁、顺铂、4-硝基-N-氧化喹啉、博来霉素、福来霉素、5-氟尿嘧啶、喜树碱和羟基脲诱变原与RNR3表达有明显的剂量效应关系。结论：该重组酵母可用于对多种化学诱变原的快速筛选。2.重组酵母细胞W303-1A/RNR3-LacZ/GPDV5-CYP1A1的构建及对间接诱变物的筛选目的：建立由RNR3调控重组Lac Z基因及可表达CYP1A1基因的重组酵母细胞以筛选间接化学诱变物。方法：利用PCR方法从GV142质粒上扩增CYP1A1基因,将其插入到pGPDV5酵母表达载体上,构建成PGPDV5-CYP1A1酵母表达载体,将该载体转入所建立的W303-1A/RNR3-Lac Z重组酵母细胞,构建成可表达CYP1A1及受RNR3调控的Lac Z基因酵母细胞。用Promega公司的试剂盒检测CYP1A1表达,并用间接诱变原2-氨基芴作用于该重组基因酵母细胞,观察其对RNR3的诱导表达,用Excel软件进行分析。结果：DNA测序表明pGPDV5-CYP1A1酵母表达载体构建成功,并经PCR鉴定已经成功重组于酵母细胞,但经检测发现CYP1A1活性较低,细胞经2-氨基芴作用后,与Lac Z表达无明显时间剂量效应。结论：CYP1A1表达量不足,可能在转录或翻译过程中受到某些因素的阻断,导致该重组酵母细胞不能很好的筛选间接诱变原,其原因还有待进一步研究。
【关键词】：化学诱变原 酵母 β-半乳糖苷酶 Lac Z基因 CYP1A1
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要2-4
• 英文摘要4-8
• 第一章 文献综述8-16
• 参考文献14-16
• 符号说明16-17
• 第二章 直接诱变原的筛选17-38
• 1. 材料与方法17-29
• 2. 结果29-38
• 第三章 间接诱变原的筛选38-56
• 1. 材料与方法38-49
• 2. 结果49-56
• 讨论56-60
• 参考文献60-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间发表的学术论文目录64-65

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本文编号：327585