基于过表达研究氟对TGF-β信号通路的影响

发布时间：2017-04-27 04:07

  本文关键词：基于过表达研究氟对TGF-β信号通路的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]通过研究TGF-β1过表达载体瞬时转染氟暴露下的小鼠睾丸支持细胞,旨在研究氟暴露对小鼠睾丸支持细胞免疫豁免功能的影响机理,对研究氟对生殖系统的毒理作用有重要的意义,从而对氟中毒治疗提供理论依据。[方法]本实验通过设置不同浓度梯度的氟化钠溶液模拟小鼠体内氟对睾丸支持细胞免疫豁免功能的影响。通过双酶切、琼脂糖凝胶回收等方法构建TGF-β1过表达模型;通过瞬时转染将重组载体导入事先在体外培养小鼠睾丸支持细胞中；应用Real-time-PCR技术研究氟对smad2、smad3、smad4、smad6、smad7等基因的mRNA表达的影响；利用酶联免疫吸附测定试验(ELISA)技术检测细胞上清液中IL-6和TNF-α的表达水平变化,从而说明氟暴露对睾丸支持细胞免疫豁免功能的影响。[结果](1)电泳及测序结果表明：过表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1构建成功。(2) Real time-PCR和Western Blotting结果表明：过表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1成功转染小鼠睾丸支持细胞。(3) Real time-PCR结果表明：与对照组相比,实验组的smad2、smad4 mRNA表达水平均未有明显差异;但相比对照组和10~(-3)mM、10-5mM NaF组,10~(-4)mM NaF对smad3基因影响差异显著;相比对照组和10-5mM NaF组.10~(-3)mM、10~(-4)mM NaF对smad6基因影响差异极其显著;相比对照组而言,10~(-3)mM、10~(-4)mM 10-5mM NaF对smad7基因影响差异均极其显著。(4)酶联免疫吸附测定试验(ELISA)结果说明：在TGF-β1过表达及不同浓度的氟暴露双因子作用下,相比对照组,实验组IL-1β、IL-6及TNF-α因子表达水平均在最大氟浓度处有明显提高且差异显著;其中,IL-1β和TNF-α因子均在10~(-3)mM NaF处浓度变化差异明显,而IL-6因子在10~(-3)mM、10~(-4)mM NaF处浓度变化均有较大差异。[结论]氟是通过影响TGF-β1表达水平的变化,而对小鼠睾丸支持细胞免疫豁免功能产生破坏作用,从而对机体产生生殖毒性。
【关键词】：TGF-β1 氟暴露 睾丸支持细胞 免疫豁免
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要6-7
• 前言7-8
• 1 文献综述8-14
• 1.1 TGF-β信号通路研究进展8-12
• 1.1.1 TGF-β信号通路结构组成8-10
• 1.1.2 TGF-β信号通路重要的生理功能10-12
• 1.2 免疫豁免研究进展12-13
• 1.3 小鼠睾丸支持细胞研究进展13-14
• 1.3.1 睾丸支持细胞的发现13-14
• 2 材料与方法14-29
• 2.1 实验材料14-18
• 2.1.1 主要试剂14-17
• 2.1.2 主要仪器17-18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 构建真核表达载体18-21
• 2.2.2 支持细胞分离与培养21-22
• 2.2.3 真核表达载体转染支持细胞的鉴定实验22-27
• 2.2.4 氟化钠对TGF-β信号通路的影响实验27-29
• 3 实验结果29-37
• 3.1 构建真核表达载体29-31
• 3.1.1 小鼠pcDNA3.1-TGF-β1重组载体的构建29
• 3.1.2 重组载体测序结果29-31
• 3.2 支持细胞的分离与培养31-32
• 3.2.1 细胞形态学观察31
• 3.2.2 支持细胞姬姆萨染色结果31-32
• 3.2.3 GATA4免疫荧光和免疫组化染色结果32
• 3.3 真核表达载体转染支持细胞的鉴定32-34
• 3.3.1 qRT-PCR检测支持细胞中TGF-β1过表达情况32-34
• 3.3.2 蛋白水平的检测TGF-β_1的表达情况34
• 3.4 氟化钠对TGF-β信号通路的影响34-37
• 3.4.2 荧光定量PCR检测目的基因mRNA表达结果35-36
• 3.4.3 相关免疫因子含量变化情况36-37
• 4 分析与讨论37-41
• 4.1 构建真核表达载体37
• 4.1.1 酶切位点的正确选择37
• 4.1.2 目的片段中引入Kozak序列的目的37
• 4.2 支持细胞分离与培养37-39
• 4.2.1 小鼠睾丸支持细胞的体外培养与细胞传代38
• 4.2.2 小鼠支持细胞的生物学鉴定方法38-39
• 4.3 真核表达载体转染支持细胞的鉴定39
• 4.4 氟化钠对TGF-β信号通路的影响实验39-41
• 4.4.1 检测IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β_1的原因39-40
• 4.4.2 Smad7蛋白表达下调的解释40-41
• 5 结论41-42
• 5.1 构建真核表达载体41
• 5.2 支持细胞的分离与培养41
• 5.3 真核表达载体转染支持细胞的鉴定41
• 5.4 氟化钠对TGF-β信号通路的影响实验41-42
• 全文结论42-44
• 参考文献44-48
• Abstract48-50
• 致谢50

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  本文关键词：基于过表达研究氟对TGF-β信号通路的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：329867