武汉市部分菜场食品中产志贺毒素大肠杆菌的分布和生物学特征

发布时间：2017-04-30 23:11

  本文关键词：武汉市部分菜场食品中产志贺毒素大肠杆菌的分布和生物学特征，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin producing Escherichia coli,STEC)是一种重要的食源性致病菌,可引起暴发性流行感染事件,近年来该菌引起人的感染致病事件日益增加。本课题主要研究武汉市售食品中STEC的流行状况,同时对分离株的毒力基因、志贺毒素滴度、生物膜及耐药性等进行鉴定,以确定这些菌株的生物学特征。从22家菜场和超市采集样品161份,进行PCR检测,有35份样品污染有O157型STEC,20份样品污染非O157型STEC,其中4份样品污染有O45型STEC,1份样品污染有O145型STEC,1份污染有O111型STEC。污染了STEC的55份样品中只检出stx1基因的有1份(1.8%),只检出stx2基因的有41份(74.5%),同时检出stx1和stx2基因的有13份(23.6%)。污染O157型STEC的样品有27份eae基因检测结果呈阳性,污染非O157型STEC的样品没有检测出hly基因。综合分析发现,O157型STEC在猪肉样品中的检出率最高;而非O157型STEC在牛肉样品中的检出率最高;同时在禽类样品中也检测出O157型STEC,但未检测出非O157型STEC;鱼肉和蔬菜样品没有检测出STEC。对27份eae基因检测呈阳性的样品通过免疫磁珠收集、血清学鉴定、菌落PCR复筛进行分离。共分离出5株O157菌株。对其毒力基因检测发现,有4株菌携带eae、hly、ehx A基因。EC5.11仅携带stx2基因,其余3株菌还同时携带stx1基因和stx2基因。分离株EC9.102不携带上述毒力基因。除EC9.102仅携带rfbO157基因外,其余四株菌均携带fli CH7和rfbO157基因,说明这四株菌为O157:H7血清型。在Vero细胞毒性试验中,对5株分离株进行Stx毒素检测,结果菌株EC9.102滤液对Vero细胞生长无明显影响,其余4株O157:H7菌均对Vero细胞有明显的毒性。4株菌的毒素滴度有一定差异,其中EC9.101和EC9.12与临床菌株EC150的毒力相同,菌株的毒素滴度为1×104CD50/m L。采用分型引物对4株O157:H7菌的stx基因亚型进行鉴定。结果发现除EC5.11外,其余3株菌stx基因亚型为stx1a和stx2a。通过对EC5.11的stx2基因全长测序,并进行序列比对发现,其stx2基因为stx2c亚型。q基因鉴定显示,EC5.11为q21型,其余3株菌为q933型。对4株O157:H7分离株采用K-B纸片扩散法进行耐药性检测,结果显示4株菌对头孢噻肟、庆大霉素、氯霉素、环丙沙星、头孢吡肟、新霉素及氨苄青霉素均呈现高敏反应;四环素和多粘菌素B对其中3株菌抑制效果很强,但对另一株菌EC9.12抑制有限,该菌对这两种抗生素呈中介反应。实验中还设计了两种选择性平板对非O157型STEC进行初步分离,发现非O157型STEC与O157型STEC菌落形态区别不大。本次实验从武汉市售食品中分离到4株O157:H7菌,这是首次从武汉市售食品中分离出产志贺毒素的O157型STEC,其中EC5.11是致病性很高的stx2c亚型,说明武汉市O157的毒力状况发生了改变,存在感染和流行O157的潜在风险,应该引起足够的重视。O45是发现最多的非O157型STEC,这与国外报道的有所不同。表明STEC在武汉市的分布状况可能与欧美国家不同,需要对武汉市的非O157型STEC进行更深入的研究,为武汉市STEC的防控提供更系统的数据。
【关键词】：产志贺毒素大肠杆菌 Vero细胞毒性试验 stx分型 分离鉴定 药敏实验
【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 1 绪论13-23
• 1.1 STEC的生物学特性13-14
• 1.2 STEC的毒力因子14-16
• 1.2.1 志贺毒素14-15
• 1.2.2 紧密素及AE损伤15-16
• 1.2.3 肠溶血素16
• 1.2.4 凝集素16
• 1.3 STEC的分离鉴定方法16-20
• 1.3.1 富集培养16-17
• 1.3.2 STEC的平板分离17-18
• 1.3.3 STEC的PCR检测方法18-19
• 1.3.4 STEC的免疫磁珠分离法19
• 1.3.5 Vero细胞毒性试验19-20
• 1.3.6 血清凝集试验20
• 1.4 STEC的污染现状20-21
• 1.5 研究目的与意义21-23
• 2 实验材料和方法23-46
• 2.1 实验材料23-27
• 2.1.1 实验菌株23
• 2.1.2 主要试剂23-24
• 2.1.3 相关试剂的配制24-25
• 2.1.4 试验仪器与设备25-27
• 2.2 实验方法27-46
• 2.2.1 食品中STEC的分离筛选流程27-28
• 2.2.2 食品中O157的检测28-30
• 2.2.3 非O157型STEC检测30-31
• 2.2.4 O157单菌的分离31-32
• 2.2.5 非O157型STEC的分离32-33
• 2.2.6 O157分离株毒力因子鉴定33-35
• 2.2.7 Vero细胞毒性试验35-37
• 2.2.8 分离菌q基 因检测37
• 2.2.9 分离菌stx基因亚型鉴定37-38
• 2.2.10 菌株EC5.11 stx2基因克隆测序38-41
• 2.2.11 药物敏感性试验41-43
• 2.2.12 生物膜试验43
• 2.2.13 噬菌体试验43-45
• 2.2.14 培养基添加剂对非O157型STEC生长的影响45
• 2.2.15 选择性培养基对STEC的筛选作用45-46
• 3 结果与分析46-68
• 3.1 食品中STEC的流行特点46-49
• 3.2 非O157型STEC的检测及分离49-50
• 3.3 O157菌株的分离50-52
• 3.4 毒力因子检测52-55
• 3.5 Vero细胞毒性试验55-57
• 3.6 q基因检测57-58
• 3.7 stx亚型鉴定58-59
• 3.8 EC5.11 stx2基因的克隆59-61
• 3.9 EC5.11 stx2基因测序与分析61
• 3.10 药物敏感性试验61-62
• 3.11 生物膜试验62-63
• 3.12 噬菌体的诱导63-64
• 3.13 添加剂对STEC的影响64-65
• 3.14 选择性培养基对STEC的筛选结果65-68
• 4 结论68-70
• 参考文献70-80
• 致谢80-81
• 攻读学位期间的研究成果81

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