甲硝唑兽药残留酶联免疫分析方法

发布时间：2017-05-01 19:13

  本文关键词：甲硝唑兽药残留酶联免疫分析方法，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：论文针对动物源性食品中甲硝唑及其结构类似物的非法添加,研究并建立了系统的酶联免疫检测方法。 对于甲硝唑,从其结构类似物1-(2-氨乙基)-甲基-5-硝基咪唑二盐酸盐出发合成半抗原,通过戊二醛一步法使其咪唑环上的氨基直接与载体蛋白连接。从其本身出发合成半抗原采用了琥珀酸酐及氯乙酸乙酯法及Linker法。对于Linker法,选择牛甲状腺素蛋白作为载体蛋白并使其先与2,2-(乙烯二氧)双(乙胺)连接,接着使用甲硝唑与N-N二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接,最后两者继续进行连接形成一个超长链完全抗原。对于琥珀酸酐及氯乙酸乙酯修饰半抗原法,采用琥珀酸酐连接法使甲硝唑与载体蛋白之间连接上一个7原子长度的链等。以上种种方法共制备出10种完全抗原。 按照不同的免疫方案免疫新西兰大耳白兔,最后由戊二醛法制备的完全抗原得到高特异性和高灵敏度的多克隆抗体。利用混合酸酐法将由甲硝唑制备出的半抗原MSA与辣根过氧化物酶偶联制备酶标。通过优化包被抗体量、酶标稀释倍数、封闭液、缓冲液pH、发光底物溶液和发光酶标板,建立了直接竞争酶联免疫法与化学发光直接竞争酶联免疫法CLEIA。直接竞争酶联免疫法对甲硝唑的灵敏度(IC50)为0.30±0.04μg/mL,检出限(IC15)为0.036±0.003μg/mL。建立的CLEIA方法对甲硝唑灵敏度(IC50)为0.022±0.004μg/mL,检出限(IC15)为0.004±0.0003μg/mL。 在直接竞争酶联免疫法中对于二甲硝基咪唑、替硝唑、奥硝唑的交叉反应率为194%、76%、115%,说明本文建立的方法除了可以检测甲硝唑兽药残留外,可以同时检测其他三种硝基咪唑类药物多残留。选择鸡肉、虾样品进行添加回收实验,样品被分别添加了浓度为1.2μg/g、6μg/g、20μg/g的甲硝唑,经过基质影响的消除后应用所建立的直接竞争酶联免疫法检测,回收率在58.54%到111.64%之间。 本研究建立的两种检测方法灵敏度高,特异性好,适合多种禽类及水产品中甲硝唑及硝基咪唑类药物多残留的快速检测。
【关键词】：甲硝唑 硝基咪唑类 酶联免疫 直接竞争 化学发光
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S859.84;R155.5
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-18
• 1.1 硝基咪唑类药物简介8-11
• 1.1.1 硝基咪唑类药物的抗菌特性及作用机制9
• 1.1.2 硝基咪唑类药物对动物及人类的影响9-10
• 1.1.3 硝基咪唑药的药代动力学10
• 1.1.4 硝基咪唑类药物对食品的污染及残留限量10-11
• 1.2 酶联免疫分析法概述11-15
• 1.2.1 基本原理11
• 1.2.2 半抗原的合成与完全抗原的制备11-12
• 1.2.3 抗体的制备12-13
• 1.2.4 酶联免疫吸附测定法的类型13-15
• 1.3 甲硝唑的常用分析方法简介15-16
• 1.3.1 甲硝唑的仪器分析法简介及其研究现状15
• 1.3.2 甲硝唑的酶联免疫方法简介及其研究现状15-16
• 1.3.3 甲硝唑实际样品分析的基质影响及其消除方法16
• 1.4 论文研究的目的及意义16-17
• 1.5 研究内容17-18
• 2 材料与方法18-31
• 2.1 实验材料18-21
• 2.1.1 实验药品与试剂18-19
• 2.1.2 仪器及设备19-20
• 2.1.3 基质样品20
• 2.1.4 常用溶液的配制20-21
• 2.2 实验方法21-31
• 2.2.1 甲硝唑半抗原的制备21-22
• 2.2.2 甲硝唑免疫原的制备22-24
• 2.2.3 甲硝唑包被原的制备24
• 2.2.4 酶标抗原的制备24-25
• 2.2.5 甲硝唑多克隆抗体的制备25-27
• 2.2.6 甲硝唑直接竞争酶联免疫检测方法的建立27-28
• 2.2.7 化学发光直接竞争酶联免疫检测方法(CLEIA)的建立28-29
• 2.2.8 甲硝唑抗体特异性的测定29-30
• 2.2.9 样品前处理30
• 2.2.10 样品的添加回收实验30-31
• 3 结果与讨论31-48
• 3.1 甲硝唑半抗原及完全抗原的设计与表征31-36
• 3.1.1 甲硝唑半抗原及完全抗原设计思路31
• 3.1.2 合成半抗原的结构表征31-33
• 3.1.3 免疫原鉴定33-36
• 3.2 甲硝唑抗体的制备36-37
• 3.2.1 抗血清亲和性的测定36
• 3.2.2 抗体的纯化及浓度测定36-37
• 3.3 直接竞争酶联免疫检测法的建立37-39
• 3.3.1 甲硝唑直接竞争酶联免疫工作条件的筛选37-38
• 3.3.2 直接竞争酶联免疫方法标准曲线的绘制38-39
• 3.4 化学发光直接竞争酶联免疫法检测法(CLEIA)的建立39-42
• 3.4.1 甲硝唑化学发光直接竞争酶联免疫法工作条件的筛选39-41
• 3.4.2 化学发光直接竞争酶联免疫法标准曲线的绘制41-42
• 3.5 甲硝唑直接竞争ELISA及CLEIA检测方法性能指标的评价42-44
• 3.5.1 检测限42
• 3.5.2 精密度42-44
• 3.6 甲硝唑抗体的特异性的测定44-45
• 3.7 样品基质影响的消除45-47
• 3.7.1 鸡肉的基质消除45-46
• 3.7.2 虾的基质消除46-47
• 3.8 样品添加回收实验47-48
• 4 结论48-49
• 5 展望49-50
• 6 参考文献50-56
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况56-57
• 8 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：339501