EGCG对慢性铅暴露大鼠海马突触形成的影响及可能机理

发布时间：2017-05-03 03:09

  本文关键词：EGCG对慢性铅暴露大鼠海马突触形成的影响及可能机理，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：正常的大脑神经活动依赖于神经环路兴奋性与抑制性突触的平衡。铅是一种重要的环境毒和神经毒性物质,可致大脑发育和功能损伤。近年来研究显示铅是兴奋性神经递质受体NMDAR(N-甲基-D-天门冬氨酸)的一种拮抗剂,但是铅对神经环路抑制性神经递质和抑制性突触的影响尚不明确。表没食子儿茶素没食子酸(Epigallo-catechin-3-gallate, EGCG)是绿茶中一种重要的多酚类物质,具有高效清除自由基的作用,已往研究表明EGCG能明显改善铅暴露大鼠海马的氧化应激参数,且能部分修复铅暴露引起的大鼠海马学习记忆LTP的损伤。但EGCG能否通过调节神经活动的最基本机构—--突触的生成以及能否通过调节Wnt/β-catenin信号通路从而实现其对铅中毒的保护作用,目前尚不清楚。本研究铅暴露对海马神经元兴奋性突触和抑制性突触以及对树突棘形态的影响,并探讨EGCG对慢性铅暴露海马神经元突触生成损伤的修复作用及其机理。 本课题研究取新生大鼠(出生后24 h内,P0)海马组织进行细胞培养,体外培养第7天开始加入醋酸铅(1μM)处理至实验终末(DIV12),并在第10天给予EGCG (50 μM)处理48 h,观察树突棘的变化,进行电生理、免疫细胞化学、Western Blot和生物素酰化实验。整体动物实验以Sprague-Dawley (SD)母鼠喂饲300ppm醋酸铅水溶液,幼鼠自出生后至断奶(出生后第21天)经母乳铅暴露。幼鼠自从出生后第14天到21天经腹腔注射给药：EGCG (10,25和50mg/kg)。取海马脑组织,切片,Golgi-cox染色观察树突棘形态；海马组织铅含量测定；Western Blot检测Wnt7a、β-catenin和phospho-p-catenin蛋白的表达；PCR检测Wnt7a基因的表达；对原代培养的海马神经元转染Wnt7a shRNA,观察树突棘的变化。研究结果如下：1、离体培养海马神经元,1μM的铅可以引起海马神经元树突棘密度显著降低,铅暴露增加了mIPSC的频率,对mIPSC的幅度、mEPSC的频率和幅度都无显著影响；免疫细胞化学实验表明：铅暴露使氨基丁酸转运蛋白vGAT显著增加,而对抑制性突触的突触后蛋白Gephyrin,谷氨酸转运蛋白vGlut和突触后致密物PSD95无显著影响。2、铅暴露使Gama氨基丁酸转运蛋白vGAT显著增加,我们进一步研究了探究GABA的合成和突触后膜GABAA受体的变化。结果表明：铅暴露显著增加海马神经元GAD65和突触后膜表面GABAAβ2/3受体的表达。3、不同剂量EGCG (10、25、50 mg/kg)处理,铅暴露大鼠海马神经元树突棘的密度和头部大小都有显著性增加,并且表现出一定的浓度依赖性,即高浓度的EGCG(50mg/kg)对神经元具有损伤作用。铅暴露显著降低Wnt7a, β-catenin的表达,但β-catenin磷酸化水平升高。EGCG (10、25 mg/kg)能够显著上调Wnt7a的表达,同时使β-catenin的磷酸化水平降低。海马神经元转染Wnt7ashRNA, EGCG增加铅暴露海马神经元树突棘密度的功能被抑制,即EGCG可能通过调节Wnt7a/β-catenin通路信号的表达来修复铅暴露引起的突触形成的损伤。综上所述,铅暴露增加了海马抑制性神经递质合成和转运从而对兴奋性突触传递产生去抑制,损伤了海马神经元兴奋性和抑制性的平衡。EGCG通过上调Wnt/β-catenin信号通路,对铅暴露大鼠树突棘形成的损伤有一定的修复作用。
【关键词】：铅 GABA Wnt/β-catenin通路 树突棘 EGCG
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 致谢7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-17
• 第一章 绪论17-25
• 1.1 铅的神经毒性17-18
• 1.2 海马、突触与学习记忆18-19
• 1.3 树突棘的研究19
• 1.4 兴奋性和抑制性突触的平衡19-20
• 1.5 铅中毒的防治20-21
• 1.6 EGCG的研究进展21-22
• 1.7 Wnt通路22-24
• 1.8 课题研究的内容24-25
• 第二章 铅暴露对大鼠海马神经元突触形成的影响25-41
• 2.1 材料与方法25-34
• 2.1.1 主要仪器耗材25
• 2.1.2 主要试剂25
• 2.1.3 海马神经元培养25-26
• 2.1.4 电生理实验26-28
• 2.1.4.1 主要仪器26
• 2.1.4.2 主要试剂和药品26-27
• 2.1.4.3 电生理实验步骤27-28
• 2.1.5 细胞免疫荧光实验28-29
• 2.1.5.1 试剂和药品28
• 2.1.5.2 实验步骤28-29
• 2.1.5.3 图像分析29
• 2.1.6 Western Blot实验29-33
• 2.1.6.1 主要仪器29
• 2.1.6.2 主要试剂和药品29
• 2.1.6.3 主要抗体29
• 2.1.6.4 海马组织蛋白的提取29-30
• 2.1.6.5 海马组织蛋白浓度的测定及蛋白样品的准备30-31
• 2.1.6.6 Western Blot所需溶液配制31-32
• 2.1.6.7 Western Blot实验步骤32-33
• 2.1.7 细胞表面生物素酰化33-34
• 2.1.7.1 试剂33
• 2.1.7.2 实验步骤33-34
• 2.2 实验结果34-38
• 2.2.1 铅暴露对海马神经元树突棘的影响34
• 2.2.2 铅暴露对海马神经元突触传递功能的影响34-35
• 2.2.3 铅暴露对海马神经元兴奋性突触与抑制性突触数目的影响35-36
• 2.2.4 铅暴露对抑制性突触GABA合成酶GAD65的影响36-37
• 2.2.5 铅暴露对抑制性突触GABA_A受体的影响37-38
• 2.3 讨论38-41
• 第三章 EGCG对铅暴露大鼠突触形成损伤的修复作用41-57
• 3.1 材料与方法41-48
• 3.1.1 主要仪器41
• 3.1.2 药物及试剂41
• 3.1.3 实验动物41
• 3.1.4 海马组织铅含量测定41-42
• 3.1.5 Golgi-cox染色,树突棘形态分析42
• 3.1.6 Western Blot检测相关蛋白的表达42-43
• 3.1.6.1 主要仪器,主要试剂和药品(同第二部分)42-43
• 3.1.6.2 主要抗体43
• 3.1.6.3 Western Blot蛋白定量分析(同第二部分)43
• 3.1.7 RT-PCR表达检测43-46
• 3.1.7.1 材料43
• 3.1.7.2 海马组织中总量RNA的提取43-44
• 3.1.7.3 RNA浓度的测定44
• 3.1.7.4 反转录44
• 3.1.7.5 引物设计44-45
• 3.1.7.6 缓冲液配制45
• 3.1.7.7 琼脂糖凝胶配制45
• 3.1.7.8 RT-PCR检测45-46
• 3.1.8 海马神经元培养(同第二章)46-48
• 3.1.9 统计学分析48
• 3.2 实验结果48-55
• 3.2.1 大鼠海马组织铅含量测定48-49
• 3.2.2 铅暴露和EGCG对树突棘密度的影响49-50
• 3.2.3 铅暴露和EGCG对树突棘头部形态的影响50
• 3.2.4 铅暴露和EGCG对Wnt7a蛋白表达水平的影响50-51
• 3.2.5 铅暴露和EGCG对Wnt7a mRNA水平的影响51-52
• 3.2.6 铅暴露和EGCG对Wnt通路β-catenin磷酸化水平的影响52-53
• 3.2.7 EGCG对铅暴露海马神经元Wnt7a和β-catenin的影响53-54
• 3.2.8 铅暴露海马神经元转染Wnt7ashRNA,EGCG对树突棘的影响54-55
• 3.3 讨论55-57
• 参考文献57-66
• 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况66-67

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本文编号：342208