纳米二氧化硅颗粒对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤机制研究

发布时间：2017-05-09 23:12

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【摘要】：本研究以SH-SY5Y细胞为靶细胞，对纳米二氧化硅颗粒的神经细胞毒性及其机制进行研究。采用MTT实验法检测纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞存活率的影响；HE染色法观察细胞的形态学改变；FCM和AO/EB染色法检测细胞凋亡；LDH活力实验检测纳米二氧化硅对细胞膜完整性的影响；FCM检测细胞内活性氧、细胞周期、细胞内Ca2+含量、线粒体膜电位的改变；Western-blot检测细胞内线粒体通路凋亡相关蛋白Cyt C、Apaf1、Caspese-9表达的改变。 1.纳米二氧化硅颗粒的表征 透射电镜结果显示：纳米二氧化硅颗粒呈圆形，颗粒分散均匀，大小一致。应用Image J软件计算的平均粒径为70.28±6.23nm。Zeta电位检测显示：纳米二氧化硅颗粒在纯水和无血清DMEM培养液中分散均匀、电位稳定。 2.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞存活率的影响 MTT结果显示：纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，随着暴露剂量的增加，细胞存活率下降，与0μg/mL SiO2组比较，6.25，12.5，25，50μg/mL SiO2染毒组细胞存活率明显下降，表明纳米二氧化硅对SH-SY5Y细胞存在剂量相关的细胞毒作用。 3.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞形态影响 HE染色法观察细胞形态改变。纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，对照组0μg/mL SiO2组细胞形态大小基本一致，胞核较圆位于细胞中央，核仁明显。12.5，25μg/mL SiO2剂量组细胞数减少，染色质嗜碱性染色增强，50μg/mLSiO2剂量组细胞脱落增加，排列紊乱，可见部分细胞核碎裂。 4.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞膜完整性的影响 纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，细胞培养液乳酸脱氢酶（LDH）活力测定，结果显示:与对照组0μg/mL SiO2组比较，3.125，6.25，12.5μg/ml SiO2各剂量组细胞培养液中LDH活力略有升高，25，50μg/mL SiO2剂量组LDH活力升高差异具有统计学意义(P0.05)。表明纳米SiO2可以引起细胞膜损伤，膜通透性的增加。 5.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞内Ca2+的影响 纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，随着暴露剂量的增加，与对照组0μg/mL SiO2组比较，3.125，6.25，12.5，25μg/mL SiO2剂量组细胞中Ca2+浓度稍有升高，无显著差异，50μg/mL SiO2剂量组Ca2+浓度升高差异具有统计学意义(P0.05)。 6.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y氧化损伤作用 纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，随着暴露剂量的增加，ROS产生增加，6.25，12.5，25，50μg/mLSiO2剂量组与对照组0μg/mL SiO2组比较差异具有统计学意义(P0.05)。纳米SiO2对细胞的氧化损伤能力增加。 7.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响 纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，用JC-1荧光探针对SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位进行检测，P3门为红色荧光强度，结果表明：随着暴露剂量的增加，SH-SY5Y细胞的红色荧光强度升高，P3门内细胞逐渐增多，，提示SiO2处理组细胞线粒体膜电位逐渐降低，与对照组0μg/ml SiO2组比较，6.25，12.5，25，50μg/mL SiO2剂量组细胞线粒体膜电位降低明显，差异具有统计学意义(P0.05)，其中，50μg/mL SiO2剂量组出现早期凋亡细胞。纳米SiO2可以降低线粒体膜电位，造成线粒体损伤。 8.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞周期的影响 纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，细胞周期检测发现，随着暴露剂量的增加，G0/G1期细胞减少，其中，25和50μg/mL剂量组与对照组0μg/ml组和3.125μg/mL剂量组相比，差异具有统计学意义(P0.05)。G2/M期细胞增加，50μg/mL剂量组与对照组0μg/mL组和3.125μg/mL剂量组相比，差异具有统计学意义(P0.05)。表明纳米SiO2可以造成细胞G2/M期阻滞，干扰细胞增殖。 9.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞凋亡的影响 FCM检测细胞凋亡率，结果表明：纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，随着暴露剂量的增加，细胞凋亡率增加，与对照组0μg/mL SiO2组比较，6.25，12.5，25，50μg/mL SiO2剂量组细胞凋亡率明显增加（P0.05）。AO/EB染色结果与其一致，随着暴露剂量的增加，橙染的凋亡细胞逐渐增多。 10.纳米二氧化硅颗粒对SH-SY5Y细胞线粒体通路凋亡相关蛋白的影响 纳米SiO2作用于SH-SY5Y细胞24h，Western blot检测SH-SY5Y细胞线粒体通路的凋亡相关蛋白，结果表明：其中，Caspase-9含量随纳米二氧化硅暴露剂量的增加而增加(P0.05)，12.5，25，50μg/ml SiO2剂量组细胞Apaf1与对照组0μg/ml SiO2组细胞相比差异具有统计学意义(P0.05),25，50μg/ml SiO2剂量组细胞Cyt C与对照组0μg/ml SiO2组相比差异具有统计学意义(P0.05)。 综上所述：纳米二氧化硅颗粒作用于SH-SY5Y细胞，可以降低细胞生存率，改变细胞形态和细胞膜通透性，诱导细胞内活性氧产生，引起线粒体膜电位的改变产生线粒体的损伤，增加细胞内Ca2+含量，造成细胞G2/M期阻滞和线粒体通路凋亡相关蛋白的改变，进而干扰细胞增殖增加细胞凋亡。本研究为纳米二氧化硅的安全应用，防治和预防环境纳米颗粒物导致人的神经损伤作用提供理论依据。
【关键词】：纳米二氧化硅颗粒 SH-SY5Y细胞 细胞凋亡 线粒体膜电位 周期阻滞
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-24
• 1.1 纳米材料的研究背景14-16
• 1.2 纳米二氧化硅的研究进展16-19
• 1.2.1 纳米二氧化硅的应用16-18
• 1.2.2 纳米二氧化硅的生物安全性18-19
• 1.3 纳米材料神经毒性的研究意义19-22
• 1.4 线粒体通路细胞凋亡22-24
• 第2章 材料与方法24-32
• 2.1 主要仪器与试剂24-26
• 2.1.1 主要试剂24-25
• 2.1.2 主要仪器25-26
• 2.2 纳米二氧化硅颗粒的制备与表征26
• 2.2.1 纳米二氧化硅颗粒的制备26
• 2.2.2 TEM 检测纳米二氧化硅颗粒的粒径及形貌26
• 2.2.3 Zeta 电位粒度分析仪测定纳米二氧化硅颗粒的稳定性26
• 2.3 细胞培养26-27
• 2.3.1 细胞株26
• 2.3.2 液体配制26-27
• 2.3.3 细胞培养及剂量分组27
• 2.4 MTT 法检测细胞存活率27
• 2.5 细胞形态学改变的检测27-28
• 2.6 细胞膜完整性的检测28
• 2.7 细胞内 Ca~(2+)的检测28
• 2.8 细胞内活性氧的检测28
• 2.9 细胞线粒体膜电位的检测28-29
• 2.10 细胞周期的检测29
• 2.11 细胞凋亡的测定29-30
• 2.11.1 FCM 检测细胞凋亡率29
• 2.11.2 AO/EB 染色检测细胞凋亡29-30
• 2.12 免疫印迹法（Western-blot）检测凋亡相关蛋白30-31
• 2.13 统计学分析31-32
• 第3章 实验结果32-44
• 3.1 纳米二氧化硅颗粒的表征及分散稳定性32-33
• 3.2 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞存活率的影响33
• 3.3 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞形态的影响33-34
• 3.4 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞膜完整性的影响34-35
• 3.5 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞 Ca2+的影响35-36
• 3.6 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞内 ROS 的影响36-37
• 3.7 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞线粒体膜电位的影响37-38
• 3.8 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞周期进程的影响38-40
• 3.9 纳米 SiO_2对 SH-SY5Y 细胞凋亡率影响40-42
• 3.10 细胞凋亡相关蛋白的变化42-44
• 第4章 讨论44-50
• 4.1 纳米二氧化硅的表征与稳定性44-45
• 4.2 纳米二氧化硅对 SH-SY5Y 细胞的毒性作用45-47
• 4.3 纳米二氧化硅颗粒的致 SH-SY5Y 细胞凋亡作用及其相关机制47-50
• 第5章 结论50-51
• 创新点51-52
• 参考文献52-61
• 作者简介及攻读硕士期间取得的学术成果61-62
• 致谢62

【参考文献】

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本文编号：353518