组蛋白乙酰化在氯化锰致神经细胞损害中的作用及机制初探

发布时间：2017-05-13 04:10

  本文关键词：组蛋白乙酰化在氯化锰致神经细胞损害中的作用及机制初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分氯化锰处理对PC12细胞组蛋白乙酰化水平及其调节酶表达的影响目的以PC12细胞为多巴胺能神经细胞模型,通过观察氯化锰对细胞核心组蛋白乙酰化水平的影响以及对组蛋白乙酰基转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)蛋白和m RNA表达及酶活性的影响,建立组蛋白乙酰化与重金属锰神经毒性的关系。方法(1)0、300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、6 h、12 h、24 h(每组n=3),染毒结束后,提取细胞核蛋白测定Ac-H3、Ac-H4水平;(2)用终浓度分别为0、100、300μM Mn Cl2分别对其处理0 h、3 h、6 h、12 h(每组n=3)(两因素析因设计),用“NE-PER”试剂盒提取细胞核蛋白,用HDAC Colorimetric Assay Kit和HAT Colorimetric Assay Kit分别检测HDACs和HATs的活性--酶标仪检测其吸光度;(3)0、300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、6 h、12 h、24 h(每组n=3),染毒结束后,提取细胞总蛋白,应用免疫印迹检测HAT和HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3)的蛋白表达水平;(4)0、300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、6h、12 h、24 h(每组n=3),染毒结束后,提取RNA,实时定量RT-PCR检测HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3)m RNA的表达水平。结果(1)与对照组比较,锰染毒3 h、6 h、12 h、24 h后可显著下调组蛋白H3乙酰化水平,具有时间效应关系,差异具有统计学意义(p0.01)。与对照组比较,组蛋白H4乙酰化在锰染毒3 h、6 h、12 h、24 h后均显著下降(p0.01);与3 h、12 h组比较,锰染毒24 h后,组蛋白H4乙酰化水平下降(p0.05),具有时间效应关系,差异具有统计学意义(p0.01);(2)Mn Cl2浓度(?)和处理时间(?)两因素在HDACs、HATs活性改变中具有统计学意义(p0.05)。[1]HDACs活性:?Mn Cl2处理3 h:与其他组比较,300μM Mn Cl2处理组HDACs活性均升高,差异具有统计学意义(p0.01);Mn Cl2处理6 h:与对照组比较,100μM、300μM Mn Cl2处理组HDACs活性均升高,具有统计学意义(p0.01);Mn Cl2处理12 h:与对照组比较,100μM、300μM Mn Cl2处理组HDACs活性升高,与100μM Mn Cl2处理组比较,300μM Mn Cl2处理组HDACs活性升高,具有剂量效应关系,差异具有统计学意义(p0.01)。?100μM Mn Cl2处理:与对照组、3h组比较,6 h组和12 h组HDACs活性均升高,差异具有统计学意义(p0.01);300μM Mn Cl2处理:与对照组比较,3 h组、6 h组和12 h组HDACs活性均升高;与6 h组比较,12 h组HDACs活性升高,但与3 h组比较,6 h组HDACs活性降低,差异具有统计学意义(p0.01)。[2]HATs活性:?Mn Cl2处理6 h:与对照组、100μM Mn Cl2处理组比较,300μM Mn Cl2处理组HATs活性降低,差异具有统计学意义(p0.01);Mn Cl2处理12 h:与对照组、100μM Mn Cl2处理组比较,300μM Mn Cl2处理组HATs活性降低,具有统计学意义(p0.01)。?100μM Mn Cl2处理:与对照组比较,6 h组HATs活性升高,差异具有统计学意义(p0.05);与6 h组比较,12 h组HATs活性降低,差异具有统计学意义(p0.05);300μM Mn Cl2处理:与对照组及3 h、6 h组比较,12 h组HATs活性降低,差异具有统计学意义(p0.01);(3)300μM Mn Cl2染毒3 h、6 h、12 h、24 h后发现,[1]HAT表达情况:与对照组比较,300μM Mn Cl2染毒3 h、6 h、12 h、24 h,HAT表达显著下降,差异具有统计学意义(p0.05);与6 h组比较,24 h组HAT表达下降,差异具有统计学意义,具有时间效应关系,差异有统计学意义(p0.05)。[2]HDACs表达情况:与对照组比较,300μM Mn Cl2染毒6 h、12 h、24 h,HDAC1表达显著下降,差异有统计学意义(p0.01);而300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、6 h、12 h、24 h对HDAC2表达改变无统计学意义;0、300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、6 h、12 h、24 h后,HDAC3表达显著下降,且呈时间效应关系,差异有统计学意义(p0.01)。(4)氯化锰致HDAC1 m RNA表达改变具有时间效应关系,差异有统计学意义(p0.01),与对照组比较,300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、12 h、24 h可降低HDAC1 m RNA表达(p0.01),且与3 h、6 h、12 h组比较,24 h组HDAC1 m RNA表达显著下降;与对照组比较较,300μM Mn Cl2处理PC12细胞24 h可降低HDAC2 m RNA表达(p0.01),且与3 h组比较,12 h组HDAC2 m RNA表达增高(p0.01),24 h组HDAC2 m RNA表达显著下降(p0.05),与12 h组比较,24 h组HDAC2 m RNA表达显著下降(p0.01);氯化锰致HDAC3 m RNA表达改变具有时间效应关系,差异有统计学意义(p0.01),与对照组比较,3 h组HDAC3 m RNA表达下降(p0.05),12 h、24 h组HDAC3 m RNA表达也显著下降(p0.01),且与3 h、6 h、12 h组比较,24 h组HDAC3 m RNA表达显著下降(p0.01)。综上所述,实时荧光定量PCR的结果与蛋白免疫印迹的结果基本一致,即300μM Mn Cl2处理PC12细胞均可引起HDAC1、HDAC2、HDAC3 m RNA水平以及HDAC1、HDAC3蛋白表达下降,且具有时间效应关系。结论氯化锰处理可致PC12细胞组蛋白H3,H4乙酰化水平下降,具有时间效应关系,且氯化锰处理神经细胞可诱导细胞HDACs活性升高和HATs活性降低,而氯化锰处理可致组蛋白乙酰化酶HAT蛋白表达水平降低,组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2、HDAC3 m RNA水平以及HDAC1、HDAC3蛋白表达下降,具有时间效应关系。总之,组蛋白乙酰化调控酶蛋白表达及活性的影响是锰致组蛋白乙酰化水平下降的机制之一。第二部分组蛋白乙酰化在氯化锰致PC12细胞毒性及细胞凋亡中的作用目的前期研究结果表明,氯化锰处理PC12细胞可诱导细胞组蛋白乙酰化酶(HATs)活性降低和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)活性升高。本实验以组蛋白乙酰化酶抑制剂漆树酸(Anacardic acid,AA)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)为预处理试剂,观察氯化锰处理后PC12细胞生长增殖及凋亡情况,探讨组蛋白乙酰化酶/去乙酰化酶抑制剂对氯化锰致细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法(1)体外培养高分化的PC12细胞,8.5μM AA预处理1 h,100 ng/ml TSA预处理6 h后,暴露于不同浓度氯化锰浓度(0、100、300μM Mn Cl2)和不同时间(3 h、6 h、12 h、24 h),通过CCK8检测PC12细胞的增殖情况;(2)8.5μM AA预处理1 h,100 ng/ml TSA预处理6 h之后用300μM Mn Cl2处理PC12细胞24 h,用Hoechst-33258染色荧光显微镜和Annexin-V-FLUOS流式细胞术(FCM)检测PC12细胞的凋亡情况。结果1.氯化锰对PC12细胞的增殖有明显的抑制作用,且呈时间-剂量效应关系。(1)HATs抑制剂AA预处理1 h之后进行不同氯化锰浓度和不同时间处理后发现,①氯化锰处理6 h:与300μM Mn Cl2单独处理组比较,AA预处理可促进氯化锰对PC12细胞增殖的抑制,具有统计学意义(p0.05);②氯化锰处理12 h:与100、300μM氯化锰单独处理组比较,AA预处理可促进氯化锰对PC12细胞增殖的抑制,具有统计学意义(p0.01);③氯化锰处理24 h:与100、300μM氯化锰单独处理组比较,AA预处理可促进氯化锰对PC12细胞增殖的抑制,具有统计学意义(p0.01),即组蛋白乙酰化酶抑制剂AA可促进锰对PC12细胞增殖的抑制。(2)HDACs抑制剂(TSA)预处理6 h之后进行不同氯化锰浓度和不同时间处理后发现,①氯化锰处理12 h:与100、300μM氯化锰单独处理组比较,TSA预处理可减弱氯化锰对PC12细胞增殖的抑制,具有统计学意义(p0.01);②氯化锰处理24 h:与100、300μM氯化锰单独处理组比较,TSA预处理可减弱氯化锰对PC12细胞增殖的抑制,具有统计学意义(p0.01),即组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可减弱锰对PC12细胞增殖的抑制。2.Hoechst-33258染色荧光显微镜和Annexin-V-FLUOS流式细胞术(FCM)检测结果基本一致。(1)与对照组比较,各处理组PC12细胞凋亡率均升高,差异具有统计学意义(p0.01);(2)与300μM氯化锰单独处理组比较,TSA预处理可减弱氯化锰处理所致PC12细胞凋亡,差异具有统计学意义(p0.05)。Hoechst-33258荧光染色发现,AA预处理可减弱锰所致细胞凋亡,差异有统计学意义(p0.05)。结论在一定条件下氯化锰对PC12细胞的增殖有明显的抑制作用;组蛋白乙酰化酶抑制剂AA可促进氯化锰所致PC12细胞增殖的抑制,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA则可减弱氯化锰所致PC12细胞增殖的抑制;TSA预处理后可减弱氯化锰诱导的PC12细胞凋亡。总之,组蛋白乙酰化可能是锰致神经细胞毒性和凋亡的分子事件。第三部分组蛋白乙酰化在锰致PC12细胞α-SYN、Nrf2蛋白表达改变中的作用目的通过检测HATs抑制剂、HDACs抑制剂预处理后对锰致PC12细胞α-SYN、Nrf2蛋白表达的影响,探讨锰诱导PC12细胞组蛋白乙酰化对α-SYN、Nrf2蛋白的表达的影响。方法(1)用0、300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、6 h、12 h、24 h(每组n=3),染毒结束后,提取细胞总蛋白用免疫印迹检测Nrf2、α-SYN的蛋白表达水平;(2)8.5μM AA、1 m M Na Bu预处理1 h,100 ng/ml TSA预处理6 h后暴露于300μM Mn Cl2 24 h,提取细胞总蛋白用免疫印迹检测Nrf2、α-SYN的蛋白表达水平。结果(1)0、300μM Mn Cl2处理PC12细胞3 h、6 h、12 h、24 h后,Nrf2表达显著升高,呈时间效应关系,差异有统计学意义(p0.01),而300μM Mn Cl2处理可致α-SYN蛋白表达升高,与对照组、3 h、6 h、12 h组比较,24 h组α-SYN蛋白表达水平显著升高,具有时间效应关系(p0.05);(2)PC12细胞暴露于300μM Mn Cl2 24 h可诱导Nrf2表达升高(p0.01);而HDACs抑制剂TSA、Na Bu,HATs抑制剂AA预处理,可减弱氯化锰所致Nrf2表达升高(p0.01)。结论氯化锰处理PC12细胞可诱导Nrf2、α-SYN蛋白表达,具有时间效应关系,锰可能通过α-SYN蓄积发挥神经毒性;HATs或HDACs抑制剂预处理均可减弱氯化锰所致Nrf2表达增加。
【关键词】：氯化锰 PC12细胞 组蛋白乙酰化 神经毒性 Nrf2 α-共核蛋白
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 英文缩写词汇表4-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-22
• 第一部分 氯化锰对PC12细胞组蛋白乙酰化水平及其调节酶表达的影响22-42
• 1.引言22-23
• 2.材料与方法23-32
• 3.结果32-39
• 4.讨论39-42
• 第二部分 组蛋白乙酰化在氯化锰致PC12细胞毒性及细胞凋亡中的作用42-52
• 1. 引言42
• 2. 材料与方法42-46
• 3. 结果46-50
• 4. 讨论50-52
• 第三部分 组蛋白乙酰化在氯化锰致PC12细胞α-SYN、Nrf2蛋白表达改变中的作用52-59
• 1. 引言52-53
• 2. 材料与方法53-55
• 3. 结果55-56
• 4. 讨论56-59
• 全文结论59-60
• 参考文献60-65
• 综述65-79
• 参考文献74-79
• 致谢79-80
• 攻读学位区间主要研究成果80

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