RNA干扰矽肺纤维化相关基因CXCL11/CXCR3对人胚肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

发布时间：2023-06-18 04:42

　　目的本实验购入人胚肺成纤维细胞（MRC-5细胞），通过RNA干扰技术将CXCL11-SiRNA和CXCR3-SiRNA干扰质粒分别转染入人胚肺成纤维细胞内，对矽肺纤维化相关基因CXCL11及CXCR3进行基因沉默，并用矽肺患者肺泡巨噬细胞培养上清刺激人胚肺成纤维细胞，观察细胞I、III型胶原表达情况，探讨CXCL11及CXCR3在矽肺纤维化中的作用。 方法1获取矽肺患者肺泡灌洗液，离心收集肺泡巨噬细胞（AM），观察AM形态，并做常规HE染色、抗酸染色及瑞氏染色鉴定。用含SiO2的空白培养基刺激AM18h，收集上清并过滤保存备用。2构建ShRNA表达质粒：在Pubmed网站查询获得人类基因CXCL11及CXCR3的序列号，由上海吉玛公司构建两种基因的干扰质粒及相应的阴性质粒，质粒选取pGPU6/GFP/Neo-shGAPDH为载体。3CXCL11-SiRNA和CXCR3-SiRNA由LipofectamineTM2000脂质体介导分别转染入人胚肺成纤维细胞内，用激光扫描共聚焦显微镜观察质粒转染情况；转染36～48h后提取各组细胞总mRNA和总蛋白分别用realtime-PCR和Weste...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略表
引言
第1章 实验研究
    1.1 材料与方法
        1.1.1 实验细胞及材料
        1.1.2 矽肺患者 AM 的收集及条件上清的制备
        1.1.3 人胚肺成纤维细胞（MRC-5）的培养
        1.1.4 CXCL11 及 CXCR3 基因干扰质粒的构建
        1.1.5 质粒转染及转染率的测定
        1.1.6 Realtime-PCR 检测人胚肺成纤维细胞中 CXCL11 及 CXCR3mRNA 的表达
        1.1.7 Western-blot 法检测人胚肺成纤维细胞中 CXCL11 及 CXCR3 蛋白的表达
        1.1.8 免疫细胞化学法检测转染质粒对人胚肺成纤维细胞 I、III 型胶原表达的影响
        1.1.9 Western-blot 法检测转染质粒对人胚肺成纤维细胞 I、III 型胶原表达的影响
    1.2 结果
        1.2.1 矽肺患者肺泡巨噬细胞的获取及鉴定
        1.2.2 人胚肺成纤维细胞 MRC-5 的形态观察
        1.2.3 重组质粒的测序结果
        1.2.4 激光扫描共聚焦显微镜检测转染率
        1.2.5 质粒转染入人胚肺成纤维细胞后 Realtime-PCR 检测 CXCL11 及CXCR3 的 mRNA 的表达
        1.2.6 质粒转染入人胚肺成纤维细胞后 Western-blot 法检测 CXCL11 及CXCR3 的蛋白的表达
        1.2.7 免疫细胞化学法检测质粒转染后人胚肺成纤维细胞中 I、III 型胶原的表达
        1.2.8 Western-blot 法检测质粒转染后人胚肺成纤维细胞中 I、III 型胶原的表达
    1.3 讨论
        1.3.1 矽肺的研究现状
        1.3.2 RNA 干扰技术的研究进展
        1.3.3 转染条件的优化
        1.3.4 趋化因子 CXCL11 及其受体 CXCR3 的研究
        1.3.5 矽肺患者支气管肺泡灌洗液肺巨噬细胞 AM 上清的获取
        1.3.6 矽肺纤维化相关胶原的表达情况
        1.3.7 矽肺纤维化差异表达基因的选择及基因沉默效果的检测
    1.4 结论
    参考文献
第2章 综述 CXCL11 及其受体 CXCR3 与肺纤维化
    2.1 CXCL11 的结构
    2.2 CXCR3 的结构
    2.3 CXCL11-CXCR3 在肺纤维化中的作用
    2.4 展望
    参考文献
致谢
导师简介
作者简介
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本文编号：3834803