低剂量BaP、铝联合染毒对原代大鼠神经细胞凋亡的协同作用

发布时间：2017-05-24 01:13

  本文关键词：低剂量BaP、铝联合染毒对原代大鼠神经细胞凋亡的协同作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【目的】通过研究铝、苯并[a]芘联合染毒对大鼠神经细胞凋亡的影响，探索两种毒物共同作用下致神经细胞凋亡的机制。 【方法】 1.原代皮质神经细胞培养：采用出生1～3d的SD大鼠并在无菌条件下取出大脑皮质，用0.25%胰酶消化后接种神经细胞。细胞培养5d后，选取生长良好的同批次细胞，分为：对照组、溶剂对照组(DMSO+S9+maltol)、单独染BaP组(10μmol/L BaP)、单独染铝组(50μmol/LAl(mal)3)、联合染毒组(50μmol/LAl(mal)3+10μmol/L BaP)，继续培养72h后处理细胞。 2.神经细胞基本形态学变化：①光学显微镜下观察不同实验组神经细胞凋亡的形态学变化；②透射电镜下观察不同实验组神经细胞凋亡的形态学变化；③荧光显微镜下观察，神经细胞凋亡情况（AO-EB荧光染色法）； 3.细胞凋亡相关指标的检测方法：①细胞活力测定（采用CCK8法）；②Annexin-V和PI双染法测定细胞的凋亡率；③caspase酶活性试剂盒检测caspase-8，-9，-3的活性趋势；④RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因caspase-8，-9，-3的表达。 【结果】 1.细胞活力检测结果:细胞染毒72h后，单独染BaP组(40μM)、单独染铝组(100μM、400μM)及所有联合染毒组的细胞活力明显降低(P＜0.05)，分别下降了10.81%、10.18%、18.75%、22.93%、25.99%、33.44%、29.38%、43.77%、51.25%；而溶剂对照组、染10μM BaP组和染50μMAl(mal)3组的细胞活力与对照组相比没有统计学意义(P0.05)，说明10μM的BaP或50μM的Al(mal)3具有弱毒性。析因分析结果表明，BaP与铝联合染毒致原代培养大鼠的神经细胞活力降低具有交互作用(F=21.491，P0.001)。其交互作用的均值图的曲线随着染毒剂量增大而相互远离，即交互作用为协同作用。 2.染毒后的形态学改变： ①光镜下，染10μM BaP组和染50μMAl(mal)3组变化不明显；联合染毒组出现神经细胞的数目减少、细胞胞体体积收缩、变圆，轴突缩短的现象。 ②透射电镜下，可以看到染10μM BaP组、染50μMAl(mal)3组神经元细胞出现轻微核膜皱缩，胞质致密，核染色质边集等细胞凋亡的经典形态学变化；联合染毒组出现了细胞核裂解甚至凋亡小体。 ③荧光显微镜下，对照组细胞呈AO染色的亮绿色，显示了完整的细胞膜和均匀的细胞质；染10μM BaP组、染50μM Al(mal)3组细胞呈现出少量的AO-EB共同染色的桔色凋亡细胞；联合染毒组AO-EB共同染色的桔色凋亡细胞数目明显增多。 3.细胞凋亡相关指标检测结果： ①Annexin-V和PI双染法测定细胞凋亡率结果显示，与对照组相比，染10μM BaP组总凋亡率差别没有统计学意义（P0.05）；染50μM Al(mal)3组和联合染毒组总凋亡率差别均有明显统计学意义（P0.05）。析因分析结果表明，BaP与铝联合染毒致原代培养大鼠的神经细胞降低凋亡率具有交互作用并表现为协同作用，提示二者共同作用时可使细胞损伤程度增强。各实验组分别加入了caspase-8抑制剂(C8-I)，caspase-9抑制剂(C9-I)后，结果显示，与染10μM BaP组比较，C8-I+10μM BaP组的原代神经细胞凋亡率差别没有统计学意义（P0.05），C9-I+10μM BaP组的原代神经细胞凋亡率差别有统计学意义（P0.05）；与染50μM Al(mal)3组比较，C8-I+50μM Al(mal)3组和C9-I+50μM Al(mal)3组原代神经细胞凋亡率差别均有统计学意义（P0.05）；与联合染毒组比较，C8-I+联合染毒组和C9-I+联合染毒组的原代神经细胞凋亡率差别有统计学意义（P0.05）。 ②caspase酶活性试剂盒检测结果显示：与对照组相比，各实验组的原代神经细胞中caspase-3，caspase-9酶活性均明显升高，差别有统计学意义（P0.05）；50μM Al(mal)3组和联合染毒组的原代神经细胞中caspase-8酶活性明显升高，差别有统计学意义（P0.05）。并经析因分析所得，在铝与BaP联合染毒所致原代神经细胞中caspase-8，caspase-9，caspase-3酶活性上存在交互作用，其交互作用类型为协同作用。加C8-I或C9-I抑制剂前后比较发现，caspase-8对10μM BaP致原代神经细胞凋亡的作用中生成的效应分子caspase-3活性未起到明显作用（P0.05），对50μMAl(mal)3和两者联合染毒组的原代神经细胞中生成的凋亡效应分子caspase-3活性起到一定作用（P0.05）。Caspase-9对染10μM BaP、染50μM Al(mal)3和两者联合染毒组的caspase-3活性均起到明显作用（P0.05）。 ③RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因caspase-8，caspase-9，caspase-3的表达。与对照组相比，各实验组中caspase-3，caspase-9基因表达量明显升高，差别均有统计学意义（P0.05）；染10μM BaP组中caspase-8基因表达量升高，但差别没有统计学意义（P0.05），染50μMAl(mal)3和联合染毒组中caspase-8基因表达量升高，，差别均有统计学意义（P0.05）。在caspase-8，caspase-9，caspase-3基因表达水平上，BaP和铝两者存在交互作用（P0.001），并表现为协同作用。加C8-I和C9-I抑制剂前后比较，caspase-8对染10μM BaP组中caspase-3基因未起到明显作用（P0.05），对染50μMAl(mal)3组和两者联合染毒组中caspase-3基因水平起到明显作用（P＜0.05）；caspase-9对所有实验组中caspase-3基因表达水平均起到明显作用（P＜0.05）。 【结论】 1.铝和BaP联合作用可使大鼠神经细胞的活力降低，并出现一定剂量效应关系； 2.铝和BaP联合作用使神经细胞凋亡率大大增加，初步提示两者的联合作用类型为协同作用，即两者的联合作用大大增强神经毒性效应。 3.铝和BaP联合作用是通过增强caspase-8和caspase-9的水平从而影响caspase-3水平，最终导致细胞凋亡，加强了神经细胞损伤的程度。4.铝和BaP两者的联合作用致神经细胞凋亡过程中激发了caspase-8为代表的死亡受体通 路和caspase-9为代表的线粒体通路，最终导致caspase-3的活性升高，细胞凋亡率上升，这可能是两者交互作用于神经细胞产生协同作用的机制之一。
【关键词】：铝 苯并[a]芘 协同作用 神经细胞 凋亡
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R135.1
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-21
• 结果21-37
• 总结37-38
• 讨论38-42
• 综述42-47
• 参考文献47-55
• 致谢55-56
• 个人简历56

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本文编号：389527