程序性坏死与自噬在亚硫酸钠致肝细胞损伤中的作用研究

发布时间：2017-05-25 13:25

  本文关键词：程序性坏死与自噬在亚硫酸钠致肝细胞损伤中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究程序性坏死与自噬在亚硫酸钠引起的肝细胞损伤中的作用,为探讨亚硫酸钠的肝毒性机制提供科学依据。方法:第一部分:将处于对数生长期的HL-7702分别暴露于不同浓度的Na2SO3,其终浓度分别为0.01、0.1、1和10 mmol/L,并设阴性对照组(0 mmol/L)、阳性对照组(50 mmol/L CCl4)、0.5%DMSO溶剂对照组。分别染毒2 h、4 h、12 h、24 h以及48h后,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;采用CCK-8法检测Na2SO3对肝细胞活性的影响;采用全自动生化分析仪检测不同时间段各染毒组肝细胞培养上清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)以及乳酸脱氢酶(LDH)的活性;采用Western Blot法检测程序性坏死相关蛋白受体相互作用蛋白1(RIP1)的表达水平。第二部分:将处于对数生长期的HL-7702分别暴露于不同浓度的Na2SO3,其终浓度分别为0.1、1、2.5和5 mmol/L,并设阴性对照组(0 mmol/L)、阳性对照组(20mmol/L CCl4)、0.2%DMSO溶剂对照组。分别染毒2 h、4 h、12 h、24 h以及48 h后,采用荧光素酶化学发光法测定肝细胞内ATP含量;用免疫荧光(IF)法检测自噬相关蛋白LC3的表达;用Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3、p62及AMPK蛋白的表达水平。结果:第一部分:(1)与阴性对照组相比,染毒24h和48h,10 mmol/L Na2SO3能引起肝细胞形态发生改变,染毒2h-48h,1和10 mmol/L Na2SO3引起肝细胞活性明显降低(P0.05);(2)与阴性对照组相比,仅10 mmol/L Na2SO3染毒24、48 h HL-7702细胞上清液中的ALT活力较高,差异有统计学意义(P0.05);1 mmol/L亚硫酸钠染毒4、24 h及10 mmol/L Na2SO3染毒2、4 h HL-7702细胞上清液中的AST活力较低,而10 mmol/L Na2SO3染毒24、48 h HL-7702细胞上清液中的AST活力较高,差异均有统计学意义(P0.05);10 mmol/L Na2SO3染毒2、4 h HL-7702细胞上清液中的LDH活力较低,而染毒24、48 h HL-7702细胞上清液中的LDH活力较高,差异均有统计学意义(P0.05);(3)与阴性对照组相比,染毒2h-48h各浓度Na2SO3染毒组HL-7702细胞中RIP1蛋白的表达水平均较高,差异多有统计学意义(P0.05)。第二部分:(1)与阴性对照组相比,亚硫酸钠各染毒组细胞内ATP浓度明显增加,并且随着染毒剂量的增加有上升的趋势;阳性对照组细胞ATP浓度明显增加(P0.05);(2)与阴性对照组相比,各亚硫酸钠染毒组HL-7702细胞中表征LC3蛋白表达含量的绿色荧光强度明显增加,阳性对照组HL-7702细胞中的绿色荧光强度也明显增加,尤其是24 h和48 h更为显著,提示亚硫酸钠染毒可使HL-7702细胞中LC3蛋白的表达量增加;(3)与阴性对照组相比,2-24 h Na2SO3各染毒组LC3-Ⅱ蛋白表达均明显增加(P0.05);48 h Na2SO3各染毒组,随着染毒剂量的增加,LC3-Ⅱ蛋白表达量呈降低趋势;与阴性对照组相比,2-24 h Na2SO3各染毒组p62蛋白表达均明显增加(P0.05);而48 h Na2SO3各染毒组,随着染毒剂量的增加,p62蛋白表达逐渐降低;与阴性对照组相比,2-48 h Na2SO3各染毒组AMPK蛋白表达无明显变化。结论:(1)亚硫酸钠引起RIP1蛋白表达增加的时间明显早于肝细胞形态学改变的时间,染毒剂量也明显低于细胞活性改变的剂量,因此,亚硫酸钠可能通过程序性坏死相关途径引起肝细胞损伤。(2)亚硫酸钠能引起肝细胞内LC3和p62蛋白表达先明显增加,后减少,说明亚硫酸钠能够促进肝细胞自噬作用增强,一定程度上减轻亚硫酸钠对肝细胞的程序性坏死的诱导作用。
【关键词】：亚硫酸钠 肝损伤 程序性坏死 自噬
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 程序性坏死在亚硫酸钠致肝细胞损伤中的作用14-29
• 1 材料与方法14-19
• 1.1 实验细胞株14
• 1.2 主要仪器与试剂14-16
• 1.3 细胞的复苏、培养、传代及冻存16-17
• 1.4 实验分组及染毒17-18
• 1.5 实验方法18-19
• 1.6 数据分析19
• 2 结果19-26
• 2.1 HL-7702细胞的形态学改变19-22
• 2.2 亚硫酸钠染毒对HL-7702细胞活性的影响22-23
• 2.3 亚硫酸钠染毒对HL-7702细胞培养上清液中ALT、AST、LDH活性的影响23-24
• 2.4 亚硫酸钠染毒对HL-7702细胞RIP1蛋白表达的影响24-26
• 3 讨论26-28
• 4 结论28-29
• 第二部分 自噬在亚硫酸钠致肝细胞损伤中的作用29-46
• 1 材料与方法29-33
• 1.1 实验细胞株29
• 1.2 主要仪器与试剂29-31
• 1.3 细胞的复苏、培养、传代及冻存31
• 1.4 实验分组及染毒31
• 1.5 实验方法31-33
• 1.6 数据分析33
• 2 结果33-42
• 2.1 亚硫酸钠染毒对HL-7702细胞内ATP水平的影响33
• 2.2 免疫荧光法检测LC3蛋白表达结果和Hoechst33258细胞核染色结果33-39
• 2.3 亚硫酸钠染毒对HL-7702细胞LC3、SQSTM1/p62及AMPK蛋白表达的影响39-42
• 3 讨论42-45
• 4 结论45-46
• 参考文献46-51
• 综述51-60
• 参考文献56-60
• 致谢60-61
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果61-62
• 个人简历62

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