致倦库蚊被武昌罗索线虫感染后免疫基因差异表达及功能分析

发布时间：2017-06-09 10:11

  本文关键词：致倦库蚊被武昌罗索线虫感染后免疫基因差异表达及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蚊类是多种病原体和寄生虫的传播媒介,能引起疟疾、登革热和淋巴丝虫病等严重传染性疾病,属于重要的公共卫生害虫。武昌罗索线虫(Romanomermis wuchangensis)可感染并杀死十余种库蚊及伊蚊幼虫,是一种很有发展前景的生物灭蚊剂。其感染库蚊后可引发宿主体内包括模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)在内的多种分子参与的一系列的免疫反应。昆虫通过PRRs识别和结合病原物的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecule patterns, PAMPs)来启动先天性免疫反应。C型凝集素(C-type lectins, CTLs)作为一种重要的模式识别受体,在病原的识别和清除方面发挥着多种功能并扮演着重要角色。本研究对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)被武昌罗索线虫感染后的存活率进行了分析；并通过荧光定量的方法分析了致倦库蚊被武昌罗索线虫感染后不同时期模式识别受体基因CTL12 (C-type lectin 12)、 PGRPLC (Peptidoglycan recognition protein LC)、 PGRPLE (Peptidoglycan recognition protein LE)、PGRPS1 (Peptidoglycan recognition protein S1)、 PGRPS6 (Peptidoglycan recognition protein S6), TOLL信号通路基因TOLL9A、CACT(Cactus), IMD(Immune deficiency)信号通路基因IMD (Immune deficiency) 、REL1A (Relish 1A), JAK/STAT (Janus kinase/signal transducer and activator transcription)信号通路基因DOME(Domeless)、 HOP (Hopscotch)、 STAT1A (Signal transducer and activator of transcription 1A),凝结黑化途径基因SRPN6 (Serine proteinase inhibitor 6)、CLIPC2 (Clip-domain serine protease C2),免疫效应分子基因PPO2 (Prophenoloxidase 2)、PPO5 (Prophenoloxidase 5)、CECA2 (Cecropin 2),自噬途径基因ATG5 (Autophagy-related protein 5)、ATG8 (Autophagy-related protein 8)等19个免疫相关基因的表达情况；筛选出显著下调表达的免疫基因CTL12,并对其进行了蛋白原核表达和体外功能实验,初步探究了致倦库蚊CqCTL12基因在其抵御细菌和线虫感染的免疫反应中的功能和作用。实验结果如下：1.致倦库蚊被武昌罗索线虫感染后的存活率分析。结果发现6天后感染组孑(?)的存活率极显著低于对照组(p.001),表明武昌罗索线虫对致倦库蚊具有较高的致死率。2.致倦库蚊被线虫感染后不同时期免疫基因的表达水平分析。结果表明:CTL12和PGRPLC在线虫寄生的初期(2天、4天)呈显著性下调表达(p0.05),推测其可能在库蚊抵御线虫入侵的过程中起着关键作用；而ATG5和ATG8在线虫寄生的晚期(6天)呈显著性上调表达(p0.05),推测在线虫寄生的后期库蚊体内可能出现了大量自噬现象。3. CqCTL12和CqATG8基因的序列分析。结果显示：CqCTL12基因包含486个核苷酸序列,编码162个氨基酸,蛋白分子量约为16.04kDa,含有典型的CRD结构域,其CRD结构域包括4个保守的半胱氨酸和1个Ca2+结合位点,在Ca2+结合位点中含有一个可结合半乳糖的QLD基序和一个与Ca2+依赖活性相关的WND基序；CqATG8长为357bp,编码118个氨基酸,蛋白分子量为14.056kDa。4.原核表达纯化获得重组蛋白rCqCTL12和rCqATG8。 rCqCTL12对细菌的凝集实验表明：rCqCTL12能显著凝集革兰氏阴性菌Escherichia coli和革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus,具有典型的Ca2+依赖效应。5. rCqCTL12与武昌罗索线虫感染期幼虫的体外结合。实验表明：rCqCTL12能在体外与甲醛杀死的及活体状态下的感染期幼线虫结合,且这种结合与Ca2+存在与否无关。上述实验结果表明,包括CqCTL12在内的致倦库蚊多种免疫基因在抵御线虫和细菌侵染过程中发挥着重要作用。研究结果为后续武昌罗索线虫在卫生害虫蚊类的生物防控上的应用提供了基础性资料。
【关键词】：武昌罗索线虫 致倦库蚊 荧光定量 C型凝集素 CqCTL12 CqATG8 细菌凝集 线虫结合
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R184.3
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1 前言12-26
• 1.1 武昌罗索线虫的研究概况12-13
• 1.2 武昌罗索线虫主要宿主13-14
• 1.2.1 致倦库蚊13
• 1.2.2 埃及伊蚊和白纹伊蚊13-14
• 1.3 昆虫免疫机制14-20
• 1.3.1 体液免疫14-19
• 1.3.2 细胞免疫19
• 1.3.3 自噬途径19-20
• 1.4 模式识别受体20-22
• 1.5 C型凝集素22-24
• 1.5.1 CTLs的结构特征22
• 1.5.2 CTLs在昆虫中的研究概况22-24
• 1.6 本研究的目的和意义24-26
• 2 材料与方法26-41
• 2.1 实验材料26-29
• 2.1.1 实验动物的获取26
• 2.1.2 主要菌株与载体26
• 2.1.3 主要试剂与药品26-27
• 2.1.4 主要仪器与设备27
• 2.1.5 引物序列27-28
• 2.1.6 常用溶液配制28-29
• 2.2 实验方法29-41
• 2.2.1 致倦库蚊被武昌罗索线感染虫后的存活率分析29-30
• 2.2.2 库蚊总RNA的提取30
• 2.2.3 总RNA中基因组DNA的消化和反转录30-31
• 2.2.4 致倦库蚊被线虫感染后不同时期免疫基因的表达水平31-32
• 2.2.5 CqCTL12和CqATG8基因的克隆32-34
• 2.2.6 重组蛋白rCqCTL12和rCqATG8的原核表达与纯化34-39
• 2.2.7 rCqCTL12对细菌的体外凝集39
• 2.2.8 rCqCTL12与武昌罗索线虫感染期幼虫的体外结合39-41
• 3 结果与分析41-64
• 3.1 致倦库蚊被武昌罗索线虫感染后的存活率分析41-42
• 3.2 致倦库蚊总RNA的提取和反转录42-43
• 3.3 致倦库蚊被线虫感染后不同时期免疫基因的表达水平43-52
• 3.3.1 模式识别受体43-45
• 3.3.2 Toll信号通路45-46
• 3.3.3 IMD信号通路46-47
• 3.3.4 JAK/STAT信号通路47-49
• 3.3.5 凝结黑化途径49-50
• 3.3.6 免疫效应分子50-51
• 3.3.7 自噬途径51-52
• 3.4 CqCTL12和CqATG8基因的克隆52-56
• 3.4.1 CqCTL12和CqATG8基因的扩增52-53
• 3.4.2 CqCTL12和CqATG8基因克隆载体的构建和阳性检测53
• 3.4.3 CqCTL12和CqATG8基因的序列分析53-56
• 3.5 重组蛋白rCqCTL12和rCqATG8的原核表达与纯化56-59
• 3.5.1 CqCTL12和CqATG8基因成熟肽编码区的扩增和双酶切56-57
• 3.5.2 PET32a空载质粒的提取和双酶切57
• 3.5.3 表达载体的构建、阳性检测和双酶切验证57-58
• 3.5.4 重组蛋白rCqCTL12和rCqATG8的表达和纯化58-59
• 3.6 rCqCTL12对细菌的体外凝集59-61
• 3.7 rCqCTL12与武昌罗索线虫感染期幼虫的体外结合61-64
• 4 讨论64-67
• 5 小结与展望67-68
• 参考文献68-78
• 硕士期间发表的论文78-79
• 致谢79

【参考文献】

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本文编号：435126