镉暴露致小鼠卵巢颗粒细胞激素合成障碍中Sf-1基因的表达及其DNA的甲基化

发布时间：2017-06-12 17:01

  本文关键词：镉暴露致小鼠卵巢颗粒细胞激素合成障碍中Sf-1基因的表达及其DNA的甲基化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过体外培养26日龄小鼠卵巢颗粒细胞,观察不同浓度、不同时间镉暴露后颗粒细胞形态及激素分泌功能的改变,探讨镉暴露致未成年小鼠卵巢颗粒细胞激素合成障碍中Sf-1基因的表达及其DNA的甲基化情况,为进一步研究镉暴露对卵巢细胞功能的影响及其机制提供新思路。方法:提取26日龄雌性ICR小鼠卵巢颗粒细胞进行体外培养,待细胞贴壁,形态稳定后,将细胞随机分为四组,分别加入含终浓度为0、10、20、40μM的氯化镉的细胞培养液,待染毒结束后处理。分别于染毒2 h、4 h、6 h、8 h后进行:1、倒置显微镜下观察颗粒细胞形态学的变化;2、ELISA法检测颗粒细胞培养液中E2及P4浓度;3、实时荧光定量PCR法检测Sf-1基因m RNA表达变化情况;4、Western blotting法检测SF-1蛋白表达变化情况;5、于染毒6 h后,提取颗粒细胞DNA,结合碱基特异性酶切反应与MALDI-TOF-MS检测原理,运用Sequenom公司的Mass ARRAY检测系统,检测Sf-1基因启动子区DNA甲基化情况。结果:1.镉对卵巢颗粒细胞形态学的影响:随着镉染毒剂量的增加和时间的延长,卵巢颗粒细胞发生形态学改变,染毒组与对照组比较,细胞数量减少,细胞突触收起,细胞变圆,折光性变强,高剂量组可见部分漂浮的死细胞,且随着染毒时间的延长,死细胞增多。2.(1)镉对卵巢颗粒细胞E2分泌水平的影响:①同一染毒时间下,随着染毒剂量的增加,颗粒细胞培养液中雌激素水平存在下降趋势(趋势性检验P0.01)。其中分别染毒2 h和4 h后,20μM、40μM组细胞培养液中的E2水平低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);染毒6 h和8 h后,10μM、20μM、40μM组细胞培养液中的E2水平明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。②同一染毒剂量下,随着染毒时间的增加,颗粒细胞培养液中雌激素水平存在升高的趋势(趋势性检验P0.05).其中,在10μM剂量下,染毒4 h后培养液中E2水平与染毒2 h后的水平相比明显升高,差异具有统计学意义(P0.05);Control组、20μM、40μM染毒剂量下,培养4 h、8 h后,培养液中E2水平与培养2 h后的水平相比明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)镉对卵巢颗粒细胞P4分泌水平的影响:①同一染毒时间不同染毒剂量的变化:染毒2 h后,10μM、20μM组培养液中的P4水平高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);染毒4 h后,随着染毒剂量的增加,颗粒细胞培养液中P4水平存在下降趋势(趋势性检验P0.05),其中20μM、40μM组培养液中的P4水平明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);分别染毒6 h和8 h后各剂量组培养液中的P4水平与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。②同一染毒剂量不同染毒时间的变化:Control组、10μM、40μM染毒剂量下,随着培养时间的增加,培养液中P4水平存在升高趋势(趋势性检验P0.05)。其中,0μM组经8h培养后,培养液中P4水平与染毒2 h后的比较明显升高,差异具有统计学意义(P0.05);在10μM剂量下,染毒4 h、6 h、8 h后培养液中P4水平与染毒2 h后的比较明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);在20μM剂量下,染毒4 h后培养液中P4水平与染毒2 h后的比较明显降低(P0.05)。3.镉对卵巢颗粒细胞Sf-1基因的m RNA表达的影响:(1)同一染毒时间不同染毒剂量变化:分别染毒2 h后,各染毒组颗粒细胞Sf-1基因m RNA表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);分别染毒4 h、6 h、8 h后,各染毒组Sf-1基因m RNA表达水平均低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05),且4 h、6 h、8 h实验组Sf-1基因的m RNA表达水平随着染毒剂量的增加存在着下降的趋势(趋势性检验P0.01)。(2)同一染毒剂量不同染毒时间变化:在10μM、20μM、40μM染毒剂量下,Sf-1基因m RNA表达水平随着染毒时间的延长而下降(趋势性检验P0.05)。其中,10μM剂量下染毒8 h后,Sf-1基因m RNA表达水平与染毒2 h后的水平相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);20μM剂量下染毒6 h后,Sf-1基因m RNA表达水平与染毒2 h后的水平相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);40μM剂量下分别染毒6 h、8 h后,Sf-1基因m RNA表达水平与染毒2 h后的水平相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。4.镉对卵巢颗粒细胞SF-1蛋白表达的影响:(1)同一染毒时间不同染毒剂量变化:分别染毒2 h后,各染毒组颗粒细胞SF-1蛋白的表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);分别染毒4 h后,20μM、40μM组SF-1蛋白表达水平均低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);分别染毒6 h、8 h后,各染毒组SF-1蛋白表达水平均低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05),且4 h、6 h、8 h实验组SF-1蛋白表达水平随着染毒剂量的增加存在着下降的趋势(趋势性检验P0.01)。(2)同一染毒剂量不同染毒时间变化:在10μM、20μM、40μM染毒剂量下,SF-1蛋白表达水平随着染毒时间的延长而下降(趋势性检验P0.01)。其中,10μM剂量下染毒6 h、8 h后,SF-1蛋白表达水平与染毒2 h后的水平相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);在20μM、40μM剂量下,染毒4 h、6 h、8 h后,SF-1蛋白表达水平与染毒2 h后的水平相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。5、镉对卵巢颗粒细胞Sf-1基因DNA甲基化的影响:用Sequenom DNA甲基化检测平台实际检测到的CG位点为9个,但是由于第7、8、9位点有些剂量组CG位点的甲基化率为0,所以最终纳入分析的为1-6位点,数据经整理分析结果显示Sf-1基因各组总体甲基化率均呈现较低甲基化,且与溶剂对照组比较,DAC处理组及各Cd Cl2染毒组Sf-1基因DNA启动子区CG位点甲基化率无明显改变,差异无统计学意义(P0.05)。结论:1、在本次实验条件下,镉对小鼠卵巢颗粒细胞存在一定的毒性作用,表现在细胞形态学上的改变,及一定剂量范围内抑制卵巢颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮。2、体外镉(10-40μM)暴露后,Sf-1基因m RNA和蛋白表达下调,可能是镉致激素分泌及合成障碍的重要机制之一。3、镉暴露卵巢颗粒细胞后Sf-1基因启动子区DNA呈现低甲基化状态,镉可能不是通过Sf-1基因启动子区DNA甲基化来调控Sf-1的表达。
【关键词】：镉 卵巢颗粒细胞 激素 Sf-1基因表达 DNA甲基化
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 英文缩写词汇表3-4
• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-15
• 技术路线15-16
• 一、材料与方法16-31
• 1 材料16-19
• 2 方法19-31
• 二、结果31-47
• 1 镉对小鼠卵巢颗粒细胞形态学的影响31-34
• 2 镉对小鼠卵巢颗粒细胞激素分泌的影响34-38
• 3.镉对卵巢颗粒细胞 Sf-1 的 m RNA 及蛋白表达的影响38-43
• 4 镉暴露对小鼠卵巢颗粒细胞 Sf-1 基因 DNA 甲基化的影响43-47
• 三、讨论47-51
• 1.镉暴露致小鼠卵巢颗粒细胞形态学及雌、孕激素分泌功能的影响47-48
• 2.镉暴露对小鼠卵巢颗粒细胞 Sf-1 表达的影响48-49
• 3.镉暴露对小鼠卵巢颗粒细胞 Sf-1 基因 DNA 启动子区甲基化的影响49-51
• 四、结论51-52
• 参考文献52-58
• 致谢58-59
• 综述59-65
• 参考文献63-65

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本文编号：444472