电离辐射对小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞作用的基因表达谱研究

发布时间：2017-06-14 09:12

  本文关键词：电离辐射对小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞作用的基因表达谱研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:早前在研究C60(OH)24-SLN-E的对小鼠辐射防护作用研究时,发现经过6 Gy 60Co?射线照后21天的小鼠小肠固有层细胞中的γ-H2AX foci数量远多于小肠绒毛上皮细胞,这一现象提示两种细胞在DNA修复能力上存在差异。目的:探索小肠绒毛上皮细胞和固有层细胞在DNA损伤修复能力产生差异的分子机制,寻找治疗肠型放射病的关键靶分子。方法:(1)小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞在体外进行原代培养和传代。再将每种细胞各分为两组,实验组细胞经过6Gy X线照射并修复6小时;对照组不照射。(2)细胞照射后6小时,用western blot检测分析γ-H2AX的蛋白表达水平。(3)细胞照射后6小时,提取每个样品的总RNA,合成标记探针c DNA并与基因芯片进行杂交,通过芯片扫描获得基因表达数据并进行差异基因筛选,进一步对差异基因进行GO分析和PATHWAY分析。结果:(1)成功培养并获得原代小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞。(2)X射线照射并修复6小时后,小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞的γ-H2AX蛋白表达量都上升,但两者之间没有显著的差别。(3)在参与DSB非同源末端连接和同源重组修复的基因表达中,两种细胞有9个基因存在表达差异,包括POLM、XRCC5、FEN1、XRCC2、POLD3、POLD2、EME1、RAD54B和BRCA2基因,且在小肠绒毛上皮细胞的表达都显著高于固有层纤维细胞。照射后6小时,固有层纤维细胞中RAD54B表达明显下调;除上述9个基因存在差异表达外,RAD51和RPA2也有差异表达,同样在小肠绒毛上皮细胞的表达都显著高于固有层纤维细胞。除此之外,受照后的两种细胞中,参与细胞凋亡和细胞周期调控的部分基因也有表达差异。结论:本课题成功获得了原代培养的小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞并用于基因表达差异的研究。研究发现,由于参与DNA非同源末端连接和同源重组修复相关蛋白明显高表达,受照小鼠小肠绒毛上皮细胞DNA双链断裂修复能力明显强于固有层纤维细胞,其中RAD54B基因的下调表达可能在受照小肠固有层纤维细胞DNA双链断裂修复延迟方面发挥重要作用。
【关键词】：小肠绒毛上皮细胞 小肠固有层纤维细胞 原代培养 DNA损伤修复 基因芯片
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R818
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-14
• 第一部分 小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞的原代培养14-20
• 一、实验材料14-15
• 1.实验对象14
• 2.主要试剂14-15
• 3.主要仪器和设备15
• 二、实验方法15-16
• 1.原代培养皿的准备15
• 2.上皮细胞的前处理15
• 3.组织块培养法15-16
• 4.酶消化分离法16
• 5.原代细胞传代16
• 6.原代细胞复苏16
• 三、实验结果16-18
• 四、讨论18-19
• 五、小结19-20
• 第二部分 小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞的 Γ-H2AX蛋白分析20-26
• 一、实验材料20-21
• 1.实验对象20
• 2.主要试剂20-21
• 3.主要仪器和设备21
• 二、实验方法21-23
• 1.原代细胞的处理21
• 2.蛋白样制备21-22
• 3. BCA法测蛋白浓度22
• 4.蛋白变性22
• 5.制 15%的SDS-PAGE胶22
• 6.加样和垂直电泳22
• 7.转膜22-23
• 8.封闭与抗体孵育23
• 9.上机23
• 三、实验结果23
• 四、讨论23-25
• 五、小结25-26
• 第三部分 小鼠小肠绒毛上皮细胞和固有层纤维细胞基因表达谱的研究26-54
• 一、实验材料26-28
• 1.实验对象26
• 2.主要试剂26-27
• 3.主要仪器和设备27-28
• 二、实验方法28-31
• 1.提取TOTAL RNA28
• 2.总RNA的纯化28-29
• 3.CDNA第一链和第二链一步法合成29
• 4.荧光标记CRNA合成29
• 5.CRNA纯化29-30
• 6.CRNA浓度测定30
• 7.荧光分子浓度及掺入率计算30
• 8.CRNA样品片段化和芯片杂交30-31
• 9.芯片洗涤31
• 10.芯片扫描31
• 三、实验结果31-47
• 1.RNA样品质检基本信息31-33
• 2.基因芯片检测结果33-47
• 四、讨论47-52
• 五、小结52-54
• 全文总结54-55
• 参考文献55-59
• 综述59-69
• 参考文献66-69
• 中英文缩略词对照表69-70
• 致谢70-72

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本文编号：449076