TCE致L-02肝细胞毒性中SET相关的表现遗传调控机制的初步研究

发布时间：2017-06-21 03:09

  本文关键词：TCE致L-02肝细胞毒性中SET相关的表现遗传调控机制的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：三氯乙烯(Trich Loroethy Lene,TCE)是一种工业上广泛使用的有机溶剂,同时也是一种重要的环境污染物。其可通过多种途径进入人体,肝脏作为其主要的代谢场所,三氯乙烯代谢物蓄积于肝脏,导致肝毒性发生或引发肝损伤,严重者甚至发生肝衰竭或死亡。对TCE致肝细胞毒性的作用机制了解尚浅。SET基因在肝细胞和乳腺癌细胞中高表达,其自身作为一种原癌基因,参与了生物体内多种重要的生理过程:例如细胞凋亡,转录过程,染色体复制等。课题组前期研究筛选出SET差异表达蛋白,初步研究了SET相关的表观遗传调控因子对TCE致肝细胞毒性效应的影响,检测了TCE作用下肝细胞中基因组整体甲基化变化情况。但SET相关的表观遗传调控机制是如何解释TCE诱导肝细胞毒性效应这一问题尚待研究,本论文将进一步研究SET基因启动子甲基化变化对TCE致肝细胞毒性效应的作用机制,及初步探索SET相关的mi RNA调控能否解释TCE致肝细胞毒性效应的发生机理。方法和结果 本课题从以下两方面开展研究:研究1:TCE作用下肝细胞中SET基因启动子区甲基化检测分析方法:培养L-02肝细胞,使用不同浓度的TCE(0 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L)处理L-02细胞24 h,提取细胞基因组DNA,用亚硫酸氢盐试剂盒进行修饰,设计引物后进行PCR扩增,分子克隆和测序。结果及结论:与对照组相比,TCE处理的L-02肝细胞中SET基因启动子区甲基化水平下降,且随着TCE染毒浓度的增加,SET基因启动子区甲基化水平递减。对甲基化差异位点进行分析发现,p0.05的差异甲基化位点有73个,这些位点中已知序列名称的有24个;位于转录因子结合区的差异甲基化位点有9个,这些位点上均有多个已知的转录因子结合。差异甲基化位点的出现限制了转录因子的结合,造成染色体结构稳定性改变,导致SET基因表达异常,验证了SET蛋白是TCE作用下肝细胞中的表达升高的差异蛋白(结合课题组前期研究基础)。研究2:TCE作用下肝细胞中SET相关的mi RNA调控的初步研究方法:通过mi RNA靶基因预测软件和文献查找方法初步筛选出SET相关的多个mi RNAs,然后使用RT-PCR检测这些mi RNAs的表达情况,以表达下调的mi RNAs作为研究对象。构建这些mi RNAs的病毒载体,获取相应病毒上清后转染L-02肝细胞,构建稳定高表达mi RNAs肝细胞并对其高表达效率进行鉴定。结果及结论:利用多种预测软件和文献查找初筛了9个候选mi RNAs,即mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a,mi RNA-29b,mi RNA-199a,mi RNA-194,mi RNA-221和mi RNA-129。但表达下调的mi RNAs为mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a。成功构建了其中三个mi RNAs重组病毒载体,转染L-02肝细胞后,这些mi RNAs在转染细胞中的RT-PCR分析显示,与转染空病毒载体的对照组相比,mi R-199b/21/23a等的相对表达量是对照组的1300、3、5倍以上,说明稳定高表达mi R-199b/21/23a肝细胞构建成功。
【关键词】：L-02肝细胞 SET蛋白 DNA甲基化 miRNA调控
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 三氯乙烯简介12-13
• 1.1.1 三氯乙烯的生物毒性12-13
• 1.2 SET蛋白综述13-14
• 1.3 表观遗传调控14-18
• 1.3.1 DNA甲基化15-16
• 1.3.2 mi RNA调控16-18
• 1.4 课题研究基础、目的意义及实验方案18-20
• 1.4.1 课题研究基础18
• 1.4.2 课题研究的目的意义18-19
• 1.4.3 课题研究方案19-20
• 1.5 课题研究的创新点20-21
• 第2章 材料与方法21-51
• 2.1 实验材料21-24
• 2.1.1 主要仪器设备21-22
• 2.1.2 主要试剂22-23
• 2.1.3 细胞及细胞受试物23-24
• 2.2 实验方法24-51
• 2.2.1 培养基和常用试剂的配制24-25
• 2.2.2 细胞培养和染毒25
• 2.2.3 细胞DNA提取25-26
• 2.2.4 DNA的亚硫酸氢盐修饰26-30
• 2.2.5 PCR扩增30-32
• 2.2.6 基因克隆和测序32-34
• 2.2.7 统计检验分析34
• 2.2.8 获得与SET基因关联的目的mi RNA34-37
• 2.2.9 获得mi RNA初级转录本Pri-mi RNA基因产物37-42
• 2.2.10 p CI Mamma Lian Expression Vector质粒载体的双酶切及回收42-43
• 2.2.11 p CI Mamma Lian Expression Vector质粒载体与Pri-mi RNA基因产物的连接43
• 2.2.12 连接产物的转化43
• 2.2.13 Pri-mi RNA重组质粒载体的鉴定、扩增及提取43-45
• 2.2.14 获得含绿色荧光基因的Pri-mi RNA基因序列45-47
• 2.2.15 双酶切p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体47-48
• 2.2.16 双酶切后的p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体与Zsgreen+Pri-mi R-21/23A/20A/199B产物的连接48
• 2.2.17 连接产物的转化48-49
• 2.2.18 Pri-mi RNA重组病毒载体的鉴定、扩增及提取49
• 2.2.19 转染Pri-mi RNA重组病毒载体进行病毒包装49
• 2.2.20 病毒滴度检测与浓缩49-50
• 2.2.21 病毒上清转染L-02肝细胞50
• 2.2.22 mi RNA重组病毒载体在肝细胞中的表达鉴定50-51
• 第3章 结果与分析51-80
• 3.1 TCE作用下肝细胞中SET基因启动子区甲基化检测分析51-70
• 3.1.1 DNA完整性检测51
• 3.1.2 SET基因五段启动片段的甲基化位点测序结果51-66
• 3.1.3 SET基因启动子区甲基化水平分析66
• 3.1.4 SET基因启动子区甲基化位点分析66-69
• 3.1.5 SET基因启动子区差异甲基化及其结合转录因子分析69-70
• 3.2 TCE作用下肝细胞中SET相关的mi RNA调控的初步研究70-80
• 3.2.1 候选mi RNAs的相对定量检测分析70-74
• 3.2.2 Pri-mi RNA质粒载体的鉴定74-76
• 3.2.3 Pri-mi RNA重组病毒载体的鉴定76-78
• 3.2.4 Pri-mi RNA重组病毒载体的病毒上清转染L-02肝细胞及其表达鉴定78-80
• 第4章 讨论与结论80-86
• 4.1 TCE作用下肝细胞中SET基因启动子区甲基化水平检测分析80-82
• 4.1.1 SET基因启动子区甲基化水平检测分析80-82
• 4.2 TCE作用下肝细胞中SET相关的mi RNAs调控的初步研究82-86
• 4.2.1 生物信息学筛选mi RNAs82-83
• 4.2.2 SET相关的mi RNA调控及mi RNA治疗展望83-86
• 4.3 结论86
• 课题展望86-87
• 参考文献87-96
• 附录：英文缩略词表96-97
• 综述97-109
• 参考文献103-109
• 致谢109-110
• 攻读硕士学位期间取得的成果110-112

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 彭巨成;刘益民;余日安;吴礼康;吴泰顺;朱志良;;三氯乙烯对大鼠肝细胞凋亡及c-myc和p53基因表达的影响[J];毒理学杂志;2010年04期

2 刘建军;黄海燕;赵锦;庄志雄;袁建辉;阳帆;何建凡;李习艺;;三氯乙烯诱导人L-02肝细胞适应性反应的差异蛋白质组学分析[J];中国药理学与毒理学杂志;2006年04期

3 彭巨成;刘益民;余日安;吴礼康;吴泰顺;朱志良;;三氯乙烯对大鼠肝细胞DNA损伤和氧化应激的影响[J];职业与健康;2009年24期

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本文编号：467532