金属硫蛋白对氧糖剥夺再灌注诱导星形胶质细胞损伤的保护作用

发布时间：2017-06-25 15:03

  本文关键词：金属硫蛋白对氧糖剥夺再灌注诱导星形胶质细胞损伤的保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金属硫蛋白（Metallothionein, MT）是一类富含半胱氨酸，，分子量较低的金属结合蛋白，具有解毒重金属、调节必需金属自稳和抗氧化应激的功能。目前研究发现哺乳动物体内MT共有四种亚型，其中MT-1、 MT-II（MT-I/II）和MT-III是中枢神经系统中的主要异构形式。MT-I/II主要表达于星形胶质细胞，MT-III主要表达于神经元。近年来越来越多的研究表明MT-I/II在脑缺血等疾病中有重要的神经保护功能，但其具体作用靶位和机制均还不清楚。 目的：本课题应用MT-I/II基因敲除（MT-/-）小鼠和野生型（MT+/+）小鼠，分别建立原代培养的新生小鼠脑皮层星形胶质细胞模型，并通过细胞胞氧糖剥夺培养（Oxygen glucose deprivation, OGD）和再复糖复氧，即再灌注（Reperfusion,Rep）建立体外模拟缺血再灌注模型，旨在阐明MT-I/II对OGD/Rep诱导的星形胶质细胞损伤的作用并探讨其可能的作用机制；同时观察了MT-I/II在外源性化合物（白藜芦醇）介导的星形胶质细胞保护效应中的作用。 方法与结果：分别应用C57BL/OLA129MT+/+和MT-/-新生小鼠，建立脑皮层星形胶质细胞体外原代培养模型，并针对星形胶质细胞特异性蛋白（GFAP）应用免疫细胞化学法进行细胞纯度鉴定。结果表明，培养细胞纯度可达到90%以上，通过细胞形态学观察、细胞计数表明，MT+/+和MT-/-小鼠星形胶质细胞的生长、形态学等特征均基本相似，提示生理条件下MT-I/II基因敲除对星形胶质细胞结构和功能没有显著影响。对MT+/+和MT-/-小鼠星形胶质细胞分别进行氧糖剥夺再灌注实验，通过观察细胞形态变化，检测细胞存活率、细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出率及细胞凋亡率来评价MT对OGD/Rep所致星形胶质细胞毒性的影响。结果显示，OGD对星形胶质细胞有明显的细胞毒性，且Rep过程会加剧细胞损伤。形态学观察发现细胞发生皱缩、体积变小、核周空泡化及细胞死亡，细胞存活率下降，LDH漏出率和细胞凋亡率明显增加。且MT-/-小鼠星形胶质细胞的损伤程度明显高于MT+/+型细胞，该结果表明MT的缺失使星形胶质细胞对OGD/Rep引起的细胞损伤更为敏感，可见MT-I/II对OGD/Rep引起的星形胶质细胞损伤有一定的保护作用。 白藜芦醇是一种多酚类化合物，近年来研究表明白藜芦醇对脑缺血损伤具有明显的保护作用，并提示其作用机制与MT-I/II密切相关，但具体作用机制尚不清楚。为了进一步证实MT在白藜芦醇介导的抗脑缺血损伤中的作用，我们分别将白藜芦醇加入MT+/+和MT-/-小鼠星形胶质细胞模型，旨在阐明白藜芦醇是否通过调节MT来发挥其神经保护作用。MT+/+星形胶质细胞给予不同浓度的白藜芦醇（10nM、100nM、1μM、10μM）处理，经过OGD/Rep后观察其形态学改变，选取合适浓度（10μM）进行下一步研究。对MT+/+和MT-/-星形胶质细胞给予10μM白藜芦醇处理并进行OGD/Rep，在形态学观察上得出白藜芦醇有效改善了MT+/+细胞空泡化和死亡的发生。通过对LDH漏出率的测定及与未加入白藜芦醇组进行比较，在加入了保护性药物Res后，LDH漏出有一定的降低，且对MT+/+的作用更明显，尤其在Rep阶段（P0.05），明显降低了LDH漏出率，体现了Res的保护作用。 为检测细胞的氧化损伤程度，通过荧光探针标记法检测细胞OGD/Rep及给药处理后线粒体膜电位和细胞内ROS水平，结果显示，细胞在给予OGD/Rep处理后线粒体膜电位降低，ROS水平升高，即发生氧化损伤，且MT-/-细胞损伤程度较MT+/+细胞更严重；加入保护性药物白藜芦醇后，细胞的损伤有所改善，且对MT+/+细胞保护更明显。 氧化损伤产生的ROS最先由SOD转化清除，两种细胞再灌注不同时间（2h,6h,12h,24h）后，测定MT-I/II和重要抗氧化物Mn-SOD的mRNA表达水平。结果显示，对MT+/+细胞给予OGD/Rep处理后MT-I/II在Rep24h时MT-I/II表达都显著上升，表明星形胶质细胞中MT-I/II在Rep12-24h间表达上调并发挥作用。将MT+/+与MT-/-两种细胞再灌注过程SOD表达进行比较可得出，MT+/+细胞OGD/Rep处理后Mn-SOD mRNA也在Rep24h时表达突然上升，这与MT-I/II的表达变化时间一致。MT-/-细胞在发生OGD后SOD表达减少，在Rep6h时表达上调并随着Rep时间加长表达逐渐下降，这两种细胞SOD的表达有明显的差异性，MT-/-细胞可能由于缺失了MT这一重要抗氧化蛋白，在受到氧化应激时细胞通过调节SOD等抗氧化物表达来达到自身保护作用。加入保护性药物白藜芦醇，MT-I/II mRNA在Rep6h时两者都表达上调，跟未加白藜芦醇组相比（在Rep24h显著上升），MT上调的时间提前了18h。MT+/+星形胶质细胞在Rep6h时表达上升，与未加药组相比（上升时间点为Rep24h），SOD上调的时间提前了18h，且其趋势与MT表达变化相似； MT-/-细胞在OGD后SOD水平立即下降至极低，在Rep2h时恢复至正常水平，与未加药组相比（Rep6h表达升高），SOD上调的时间提前了4h。从这些结果可得出白藜芦醇能调节MT-I/II和SOD的表达来发挥保护作用，白藜芦醇对MT+/+细胞SOD的调节水平较MT-/-更明显，也提示了白藜芦醇调节MT-I/II可能是抗氧化应激作用的作用机制。 结论：综上所述，本课题应用MT-I/II基因敲除小鼠和野生型小鼠分别建立原代培养的新生小鼠脑皮层星形胶质细胞模型，并通过细胞胞氧糖剥夺培养和再复糖复氧建立了体外模拟缺血再灌注模型。应用这些模型证实了MT-I/II对OGD/Rep诱导的星形胶质细胞损伤具有明显的保护作用，提示其作用机制与保护细胞抗氧化酶MnSOD密切相关；同时证实白藜芦醇有可能通过调节MT-I/II的表达以发挥其抗脑缺血损伤作用。
【关键词】：金属硫蛋白 氧糖剥夺再灌注 星形胶质细胞 损伤 白藜芦醇
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 缩略词表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-24
• 实验结果24-40
• 讨论40-43
• 结论43-44
• 参考文献44-47
• 文献综述47-56
• 参考文献53-56
• 个人简历56-57
• 致谢57

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 司江华;杨金升;;星形胶质细胞与睡眠的研究进展[J];国际神经病学神经外科学杂志;2009年05期

2 黎思茹;肖波;;星形胶质细胞调控癫痫发作研究的新进展[J];神经损伤与功能重建;2011年04期

3 荆丽丽;吴淑华;;氯喹抑制体外培养星形胶质细胞的激活[J];基础医学与临床;2011年10期

4 于国平,朱克,梁显胤,田东华,周湘军;实验性自身免疫性脑脊髓炎的小胶质细胞和星形胶质细胞反应[J];中华神经科杂志;1999年02期

5 刘媛;星形胶质细胞与中枢神经系统损伤[J];创伤外科杂志;1999年01期

6 熊晖,梁卫兰,母得志,吴希如;体外培养星形胶质细胞缺氧再给氧后热休克蛋白70的表达[J];中华儿科杂志;2000年04期

7 杨志军,魏玲;星形胶质细胞生物学功能研究进展[J];中华神经医学杂志;2003年05期

8 任雪萍;星形胶质细胞对脑损伤修复的影响[J];济宁医学院学报;2003年04期

9 王芳,姚红红,胡刚;Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体激动剂逆转1-甲基-4-苯基吡啶离子抑制星形胶质细胞摄取谷氨酸[J];中国临床药理学与治疗学;2004年05期

10 王本国,苏涛,廖卫平;星形胶质细胞间钙波的信号传导及作用[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;2004年05期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 曾俊;李康生;;柯萨奇病毒感染星形胶质细胞及细胞因子变化研究[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2010年

2 鲍欢;徐晓云;顾晓波;徐霞红;胡晖;;缺氧后水通道蛋白4在体外培养星形胶质细胞表达变化的实验研究[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

3 曹荣;饶志仁;;低渗刺激后缝隙连接蛋白在培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞和神经元的表达变化[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年

4 邓方;冯加纯;饶明俐;;大鼠星形胶质细胞缺氧/再复氧损伤中缝隙连接功能变化规律及机制[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

5 武明明;孙晓川;殷成;周帅;吴海涛;;载脂蛋白E基因多态性与星形胶质细胞损伤后兴奋性氨基酸变化的实验研究[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年

6 周晓燕;邬力祥;刘发益;曹莉;;大鼠脑星形胶质细胞的培养方法[A];湖南省生理科学会新世纪学术年会论文摘要汇编[C];2002年

7 王磊;蔡景霞;;星形胶质细胞膜流动性的钙调节机制[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年

8 王萍;王伟;;大鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞的细胞周期变化研究[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年

9 邓方;冯加纯;饶明俐;;大鼠星形胶质细胞缺氧/再复氧损伤中缝隙连接功能变化的规律及机制[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

10 孙圣刚;周敬华;;凝血酶对大鼠原代星形胶质细胞水孔蛋白-4表达的影响[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前7条

1 记者 胡德荣;星形胶质细胞由“天使”变“魔鬼”原因找到[N];健康报;2012年

2 记者 刘海英;星形胶质细胞可调节呼吸强度[N];科技日报;2010年

3 刘霞;脑内星形胶质细胞在实验室培育成功[N];科技日报;2011年

4 汪敏华;大脑星形胶质细胞有两种新功能[N];解放日报;2003年

5 吴一福;黄芪可调节星形胶质细胞“时间模式”[N];中国医药报;2005年

6 南方日报记者 曹斯　实习生 赵莞 张宁 通讯员 邹莹 张淼;用ATP对抗不快乐[N];南方日报;2013年

7 记者 班玮;德国脑细胞再生研究取得新进展[N];人民日报;2010年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 高蓓;视上核星形胶质细胞对急性腹腔高渗刺激引起的神经元反应的调节及其机制[D];第四军医大学;2008年

2 李学忠;星形胶质细胞在脂多糖诱导的多巴胺神经元损伤中的作用[D];苏州大学;2008年

3 曹旭;1，5-二咖啡酰奎宁酸预处理对星形胶质细胞脑缺血模型的保护作用及机制的研究[D];华中科技大学;2010年

4 黄晓佳;5-脂氧酶和半胱氨酰白三烯受体在大鼠星形胶质细胞缺氧缺糖损伤中的作用[D];浙江大学;2007年

5 王萍;星形胶质细胞与神经元细胞周期调控机制研究[D];华中科技大学;2006年

6 柳秀平;蛋白磷酸酯酶-2A对星形胶质细胞迁移的促进作用及其机制研究[D];华中科技大学;2012年

7 徐光锦;大鼠海马脑片星形胶质细胞线性膜电导及细胞间电偶联特性的研究[D];华中科技大学;2009年

8 李昕华;缺血预处理星形胶质细胞神经保护作用机制研究[D];吉林大学;2008年

9 张皓云;星形胶质细胞在帕金森病神经元铁代谢紊乱中的调节作用研究[D];青岛大学;2013年

10 张娟;皮质星形胶质细胞细胞因子不对称分布的研究[D];汕头大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 曾俊;柯萨奇病毒感染星形胶质细胞及细胞因子变化研究[D];汕头大学;2010年

2 胡佳;星形胶质细胞参与脂多糖致大鼠感染性脑水肿的作用机制[D];重庆医科大学;2011年

3 韦颖;党参成分对星形胶质细胞缺氧缺糖/再给氧损伤的保护作用[D];北京中医药大学;2005年

4 杨晓霞;星形胶质细胞微丝表达与细胞缝隙连接的关系及其在癫痫发病中的意义[D];四川大学;2005年

5 李会莉;老龄大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞在病理性痛信息加工处理中的作用[D];第四军医大学;2004年

6 彭会明;抗CD81抗体对星形胶质细胞的增殖抑制作用[D];华中科技大学;2006年

7 秦爱萍;自噬/溶酶体途径在缺血缺氧性星形胶质细胞损伤中的激活及在其细胞死亡中的作用[D];苏州大学;2008年

8 周欣;缺氧诱导的星形胶质细胞源性血管内皮生长因子对共培养的脑微血管内皮细胞的影响[D];泰山医学院;2007年

9 孙缦利;星形胶质细胞在桶状皮层功能及可塑性中的作用[D];浙江大学;2011年

10 袁彬;转化生长因子-β1对大鼠星形胶质细胞结缔组织生长因子表达的影响[D];新乡医学院;2007年

  本文关键词：金属硫蛋白对氧糖剥夺再灌注诱导星形胶质细胞损伤的保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：482507