基于对虾过敏原致敏模型筛选抗过敏乳酸菌及其调控机理研究

发布时间：2017-06-28 20:26

  本文关键词：基于对虾过敏原致敏模型筛选抗过敏乳酸菌及其调控机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：对虾等水产品食用蛋白的致敏性对食用者的安全健康存在着潜在的威胁,其致敏性的高低主要取决于食用蛋白中过敏原的种类及含量。很多研究表明,乳酸菌能够有效减缓过敏症状,调节免疫平衡。然而,有许多问题尚待解决,例如抗过敏菌株的种类及其调控的机制等。鉴于此,本研究拟以具有较高经济价值的特色物种——南美白对虾为对象,建立腹腔注射该虾肌肉蛋白的Balb/c小鼠过敏模型,经口灌胃5种乳酸菌,结合间接ELISA检测小鼠血清中特异性IgE、IgG1抗体水平以验证过敏模型的成功建立。通过苏木素-伊红／甲苯胺蓝染色以及流式细胞仪检测细胞亚群分化等手段筛选最佳抗过敏乳酸菌,最后通过不同细胞与芽孢乳酸菌09.712的共培养,测定细胞因子、mRNA表达量等的变化,研究乳酸菌调控过敏反应的机制。本研究通过比较五种乳酸菌缓解虾蛋白过敏的作用,为今后筛选具有抗过敏活性的乳酸菌提供依据,同时对于研究乳酸菌的抗过敏作用机制具有参考意义。主要研究结果如下：1、采用腹腔注射致敏、经口灌胃激发方法建立南美白对虾肌肉蛋白过敏的Balb/c小鼠动物模型。1.2 mg虾蛋白剂量组小鼠血清中特异性IgE、IgG1抗体水平增加显著且组胺含量明显高于对照组,达到了 664.08±6.52 ng/mL。小肠苏木素-伊红染色和甲苯胺蓝染色切片的形态学观察表明,1.2 mg剂量组小鼠小肠中出现炎症和上皮结构的破坏,肠内肥大细胞脱颗粒,出现了严重的肠道过敏反应,证明该过敏模型已成功建立,可用于后续实验研究。2、芽孢乳酸菌09.712有效缓解小鼠过敏症状,改善肠道形态,抑制肥大细胞脱颗粒和降低特异性IgE、IgG1抗体水平。另外,流式测定小鼠脾淋巴细胞T细胞亚群数量结果表明,芽孢乳酸菌09.712促进Th0细胞向Th1细胞方向极化,纠正Th1/Th2比值以及增加Treg细胞数量,增加Th1型细胞因子分泌。上述结果表明,芽孢乳酸菌09.712对于过敏反应具有治疗作用,可用于后续研究。3、利用流式细胞仪分选Treg细胞、Yh2细胞和B细胞,选取芽孢乳酸菌09.712作为实验菌株,采用体外实验与上述细胞共培养,虾肌肉蛋白体外刺激,ELISA法测定细胞因子含量和抗体分泌量,rt-PCR测定mRNA表达量。结果发现,芽孢乳酸菌09.712抑制IgE分泌,促进IgG4分泌,表明乳酸菌能够促进抗体转换。另外,芽孢乳酸菌09.712增强Foxp3、TGF-β以及IL-10 mRNA表达,降低Th2型细胞因子分泌,说明乳酸菌能够抑制Th2型免疫应答,调控Th1/Th2之间的免疫平衡。体外P815肥大细胞和芽孢乳酸菌09.712共培养结果表明,芽孢乳酸菌可直接作用于肥大细胞并抑制其脱颗粒,减少组胺释放。
【关键词】：南美白对虾 Balb/c小鼠 过敏反应 乳酸菌 T细胞
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 绪论11-25
• 1.1 食物过敏及其作用机制11-20
• 1.1.1 食物过敏11-16
• 1.1.1.1 食物过敏的流行病学11-12
• 1.1.1.2 食物过敏类型12-13
• 1.1.1.3 食物过敏机制13-16
• 1.1.2 食物过敏原16-19
• 1.1.3 食物过敏的动物模型19-20
• 1.2 乳酸菌抗过敏及其机制的国内外研究现状20-23
• 1.2.1 乳酸菌20-21
• 1.2.2 乳酸菌的益生作用21
• 1.2.3 乳酸菌在肠道中的免疫机制21-22
• 1.2.4 乳酸菌抗过敏机制的国内外研究现状22-23
• 1.3 本课题主要研究内容及意义23-25
• 1.3.1 研究目的及意义23
• 1.3.2 研究内容23-24
• 1.3.3 研究技术路线图24-25
• 第2章 以对虾蛋白为过敏原建立Balb/c小鼠致敏模型25-45
• 2.1 前言25
• 2.2 实验材料与方法25-36
• 2.2.1 实验对象25
• 2.2.2 主要试剂25-26
• 2.2.3 主要仪器26-27
• 2.2.4 实验方法27-36
• 2.2.4.1 虾蛋白浸液的制备27
• 2.2.4.2 蛋白含量测定27-29
• 2.2.4.3 SDS-PAGE电泳29-31
• 2.2.4.4 Balb/c小鼠致敏模型的建立31-32
• 2.2.4.5 小鼠过敏症状的得分评价32
• 2.2.4.6 小鼠血清中特异性IgE、IgG1的测定32-34
• 2.2.4.7 小鼠血清中组胺含量的测定34-35
• 2.2.4.8 小鼠肠道形态学观察35-36
• 2.2.5 数据统计学分析36
• 2.3 结果与分析36-43
• 2.3.1 南美白对虾肌肉蛋白SDS-PAGE分析36-37
• 2.3.2 小鼠过敏症状的得分评价37-38
• 2.3.3 小鼠血清中特异性IgE、IgG1水平的测定38-40
• 2.3.3.1 小鼠血清中特异性IgE水平的测定38-39
• 2.3.3.2 小鼠血清中特异性IgG1水平的测定39-40
• 2.3.4 小鼠血清中组胺含量的测定40-41
• 2.3.5 小鼠肠道形态学观察41-43
• 2.3.5.1 小肠形态学观察41-42
• 2.3.5.2 小肠肥大细胞形态学观察42-43
• 2.4 讨论43-44
• 2.5 本章小结44-45
• 第3章 不同乳酸菌调节过敏反应的比较研究45-70
• 3.1 前言45
• 3.2 实验材料与方法45-52
• 3.2.1 实验对象45-46
• 3.2.1.1 实验菌株45-46
• 3.2.1.2 实验动物46
• 3.2.2 主要试剂46
• 3.2.3 主要仪器46-47
• 3.2.4 实验方法47-51
• 3.2.4.1 菌种培养47
• 3.2.4.2 南美白对虾蛋白浸液制备47
• 3.2.4.3 Balb/c小鼠免疫方案47-48
• 3.2.4.4 致敏相关指标的测定48
• 3.2.4.5 脾脏淋巴细胞提取48-49
• 3.2.4.6 细胞因子的测定：采用双抗体夹心ELISA法49-50
• 3.2.4.7 MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖50
• 3.2.4.8 Balb/c小鼠脾淋巴细胞T细胞亚群的测定50-51
• 3.2.5 数据统计学分析51-52
• 3.3 结果与分析52-68
• 3.3.1 不同乳酸菌对致敏小鼠过敏症状的影响52-53
• 3.3.2 不同乳酸菌对致敏小鼠血清中特异性抗体含量的影响53-54
• 3.3.3 不同乳酸菌对致敏小鼠血清中组胺含量的影响54
• 3.3.4 不同乳酸菌对致敏小鼠肠道形态的影响54-58
• 3.3.4.1 小肠形态学观察55-56
• 3.3.4.2 小鼠空肠肥大细胞形态学观察及完整率56-58
• 3.3.5 不同乳酸菌对致敏小鼠脾淋巴细胞上清液细胞因子含量的影响58-63
• 3.3.5.1 小鼠脾淋巴细胞上清液中IFN-γ含量58-59
• 3.3.5.2 小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-4含量59-61
• 3.3.5.3 小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-5含量61-62
• 3.3.5.4 小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-13含量62-63
• 3.3.6 不同乳酸菌对致敏小鼠脾淋巴细胞增殖的影响(MTT)63
• 3.3.7 不同乳酸菌对致敏小鼠细胞亚群数量的影响63-67
• 3.3.7.1 Th1细胞亚群的分化64-65
• 3.3.7.2 Th2细胞亚群的分化65-66
• 3.3.7.3 Treg细胞亚群的分化66-67
• 3.3.8 不同乳酸菌对细胞分化的影响67-68
• 3.4 讨论68-69
• 3.5 本章小结69-70
• 第4章 芽孢乳酸菌09.712缓解虾蛋白源过敏反应的机理初探70-82
• 4.1 前言70
• 4.2 实验材料与方法70-76
• 4.2.1 实验对象70
• 4.2.1.1 实验菌株70
• 4.2.1.2 实验动物70
• 4.2.2 主要试剂70-71
• 4.2.3 主要仪器71
• 4.2.4 实验方法71-75
• 4.2.4.1 小鼠脾淋巴细胞的提取71-72
• 4.2.4.2 Treg细胞、B细胞和Th2细胞分选72
• 4.2.4.3 芽孢乳酸菌09.712与Treg细胞、Th2细胞共培养72-73
• 4.2.4.4 芽孢乳酸菌09.712与Treg细胞、B细胞共培养73
• 4.2.4.5 芽孢乳酸菌09.712与P815肥大细胞共培养73
• 4.2.4.6 小鼠脾脏细胞Foxp3、TGF-β和IL-1O mRNA表达测定73-75
• 4.2.5 数据统计学分析75-76
• 4.3 结果与分析76-80
• 4.3.1 Th2细胞、Treg细胞和B细胞分选76-77
• 4.3.2 芽孢乳酸菌09.712对IL-10、Foxp3、TGF-β mRNA表达的影响77-78
• 4.3.3 芽孢乳酸菌09.712对Th2型细胞因子的影响78-79
• 4.3.4 芽孢乳酸菌09.712对IgE及IgG_4抗体的影响79
• 4.3.5 芽孢乳酸菌09.712对致敏肥大细胞的影响79-80
• 4.4 讨论80-81
• 4.5 本章小结81-82
• 第5章 总结论、创新点及研究展望82-84
• 5.1 总结论82
• 5.2 创新点82-83
• 5.3 研究展望83-84
• 参考文献84-90
• 研究生期间发表论文90-91
• 致谢91-92

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 罗治彬;肠道粘膜SIgA免疫系统的研究进展[J];细胞与分子免疫学杂志;1997年S2期

  本文关键词：基于对虾过敏原致敏模型筛选抗过敏乳酸菌及其调控机理研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：495180