小胶质细胞诱导星形胶质细胞功能改变在铅锰联合暴露致认知功能损伤中的作用及机制

发布时间：2017-07-14 14:36

  本文关键词：小胶质细胞诱导星形胶质细胞功能改变在铅锰联合暴露致认知功能损伤中的作用及机制

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【摘要】：近年来,随着我国快速工业化和城市进程的发展,环境污染问题越来越受到人们的关注。铅、锰等重金属污染物造成机体多系统及器官损伤,尤其是神经系统损伤的不可逆性逐渐成为人们关注及研究的热点。以往对铅、锰等重金属的研究多集中于其单一毒性效应而忽视了其联合暴露效应及机制的研究。而任何一个个体的生存环境都是一个复杂的复合暴露环境,研究重金属污染物对机体的损害必需考虑到其联合暴露的毒性机制。星形胶质细胞(astrocyte,AS)在脑内分布极为广泛,主要起支持和分隔神经细胞的作用。近年来研究还证实AS在调节细胞外神经递质方面发挥着重要的作用,尤其是对兴奋性氨基酸—谷氨酸(glutamic acid,Glu)的调节。而谷氨酸在细胞外的蓄积被认为是产生兴奋性神经毒性的主要原因。小胶质细胞(microglia,MG)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)的免疫驻留细胞,许多研究发现在生理及病理状态下,MG都可以对AS发挥调控作用。研究发现低剂量铅(lead,Pb)能引起神经系统损伤,同时铅暴露可以诱导不同发育阶段仔鼠大脑海马中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酸转运体谷氨酸-胱氨酸转运体(glatamate aspartate transporter,GLAST)和谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1,GLT-1)等蛋白表达的降低,而这些转运体或蛋白都是星形胶质细胞重摄取细胞外谷氨酸并合成谷氨酰胺的关键性蛋白。有研究显示锰(manganese,Mn)摄入过量可以对中枢神经系统造成毒性损伤,能影响星形胶质细胞GS的活性以及GLAST和GLT-1的表达。我们课题组前期研究发现铅、锰在单独暴露下能够诱导MG活化,结合铅、锰暴露对星形胶质细胞活性及其谷氨酸-谷氨酰胺循环的影响,我们推测在铅、锰联合暴露中小胶质细胞活化可能会调控星形胶质细胞功能进而影响神经元功能,从而最终诱导认知功能的损伤。研究目的:本实验以SD大鼠、BV2细胞、C6细胞、原代小胶质细胞及星形胶质细胞为研究对象,探讨低剂量铅锰联合暴露对不同类型胶质细胞活化顺序的影响以及对神经元胶质细胞间谷氨酸-谷氨酰胺循环的影响,阐明小胶质细胞诱导星形胶质细胞功能改变在铅锰联合暴露致认知功能损伤中的作用及机制,为低剂量铅锰联合暴露致学习记忆功能损伤提供新的理论依据。研究方法:1.饮水染毒建立铅锰联合暴露动物模型;建系细胞和原代细胞建立体外共培养模型。2.原子吸收分光光度法检测SD大鼠血铅和血锰含量;膜片钳技术检测LTP;通过水迷宫实验检测大鼠逃避潜伏期时间和目的象限停留时间百分比评价大鼠的学习记忆能力。MTT筛选建系细胞体外染毒剂量;免疫荧光法和Western blot筛选原代细胞体外染毒剂量。3.免疫荧光法和Western blot检测胶质细胞的活化和谷氨酸-谷氨酰胺循环相关蛋白的表达。研究结果:1.铅锰联合暴露动物模型的建立在100ppm Pb、2.5g/L Mn、5g/L Mn、Pb+2.5g/L Mn和Pb+5g/L Mn的暴露剂量下,通过原子吸收法检测血铅和血锰含量、膜片钳技术检测LTP的诱导水平和水迷宫实验筛选出铅的染毒剂量为100ppm,锰的剂量为2.5g/L。2.铅锰联合暴露对认知功能损伤的协同效应1)染毒3w后,各暴露组LTP诱导水平与对照组相比均显著降低(p0.05),并在联合暴露组出现协同损伤效应。2)水迷宫检测结果显示,各暴露组大鼠逃避潜伏期时间和目的象限停留时间百分比与对照组相比差异显著,联合暴露时差异更为显著(p0.05)。3.铅锰联合暴露对不同类型胶质细胞活化的时间效应及活化后的影响1)免疫荧光法和Western blot法检测SD大鼠海马部位小胶质细胞和星形胶质细胞的形态及各自特异性活化maker的表达水平。结果显示,暴露3d后,与对照组相比,铅锰联合暴露组小胶质细胞出现显著活化,OX-42表达水平明显升高(p0.05);而星形胶质细胞形态未发生改变。5d后,各暴露组小胶质细胞均呈现活化状态并在联合暴露时更显著,此时星形胶质细胞在联合暴露组也出现了显著活化,GFAP表达水平显著升高(p0.05)。Western blot法检测海马星形胶质细胞谷氨酸-谷氨酰胺循环相关蛋白的表达水平,结果显示,暴露2w后,GS、GLT-1和GLAST的表达水平明显降低,且在联合暴露时降低更为显著(p0.05)。2)筛选合适的铅锰联合暴露体外染毒剂量10μmol/L醋酸铅和100μmol/L氯化锰,时间为24h。建系细胞与原代细胞在直接刺激时GFAP、GS、GLT-1和GLAST蛋白表达水平与对照组相比均没有明显改变。共培养后,铅锰联合暴露可以引起GS、GLT-1和GLAST表达降低(p0.05)。4.米诺环素干预对铅锰联合暴露毒性损伤的拮抗作用1)用米诺环素(Minocycline)拮抗小胶质细胞活化后,与各暴露组相比,米诺环素干预组大鼠空间学习记忆功能的损伤得到一定程度的缓解(p0.05)。2)免疫荧光法检测暴露2w后海马部位胶质细胞的形态,发现各暴露组小胶质细胞及星形胶质细胞均出现显著活化,联合暴露活化更为明显;在米诺环素干预下各暴露组小胶质细胞活化和星形胶质细胞活化均得到显著抑制(p0.05)。Western blot结果显示,各暴露组GS、GLT-1和GLAST表达水平出现降低,在联合暴露时出现协同降低,米诺环素干预后各暴露组谷氨酸-谷氨酰胺循环相关蛋白表达水平的降低得到显著回升(p0.05)。研究结论:1.低剂量铅锰联合暴露可以产生协同神经毒性,导致学习记忆功能受损;2.胶质细胞活化参与了铅锰联合暴露所诱导神经毒性进程。在铅锰联合暴露条件下,小胶质细胞首先被激活,继而星形胶质细胞出现活化进而导致星形胶质细胞与神经元间的谷氨酸-谷氨酰胺循环遭到破坏,使神经元功能受到损伤,证实了星形胶质细胞在学习记忆功能中的重要作用;3.以米诺环素拮抗小胶质细胞活化后,星形胶质细胞活性及其谷氨酸-谷氨酰胺循环的损伤得到显著缓解,学习记忆功能的损伤也得到显著恢复,揭示了小胶质细胞活化在星形胶质细胞的功能改变中发挥着重要作用。
【关键词】：铅 锰 小胶质细胞 星形胶质细胞 谷氨酸-谷氨酰胺循环 学习记忆
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-26
• 实验一 铅锰联合暴露动物模型的建立26-33
• 1 材料26-27
• 2 方法27-29
• 3 结果29-31
• 4 讨论31-33
• 实验二 铅锰联合暴露对认知功能损伤的协同效应33-38
• 1 材料33-34
• 2 方法34-35
• 3 结果35-37
• 4 讨论37-38
• 实验三 铅锰联合暴露对不同类型胶质细胞活化的时间效应及活化后的影响38-61
• 1 材料38-41
• 2 方法41-46
• 3 结果46-58
• 4 讨论58-61
• 实验四 米诺环素干预对铅锰联合暴露毒性损伤的拮抗作用61-69
• 1 材料61-63
• 2 方法63-64
• 3 结果64-67
• 4 讨论67-69
• 小结69-70
• 参考文献70-82
• 个人简历和研究成果82-83
• 致谢83

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