光谱法结合高效液相色谱法定量分析壳聚糖

发布时间：2017-08-11 10:33

  本文关键词：光谱法结合高效液相色谱法定量分析壳聚糖

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【摘要】：研究目的建立功能性食品等样品中壳聚糖准确定量的方法体系。研究方法壳聚糖在弱酸性溶液中由于质子化而产生氨基阳离子,利用静电引力和疏水作用力与阴离子染料结合成稳定的离子缔合物,根据结合后体系光谱学特征的改变,建立多种共振瑞利散射法和荧光猝灭法定量分析壳聚糖。优化实验条件;探索分子量的影响,并寻找解决解决壳聚糖分子量影响的方法;探索多种共存物质的影响并寻找合适的离子掩蔽剂;利用所建立的共振瑞利散射及荧光猝灭新方法测定样品中壳聚糖含量。并将荧光猝灭法与共振瑞利散射法测定结果相比较。HPLC法先将壳聚糖在氮气保护下水解成氨基葡萄糖,通过测定氨基葡萄糖衍生化产物间接测定壳聚糖含量,并将此结果与紫外分光光地法测得氨基葡萄糖结果相比较。研究结果1、胭脂红、刚果红作探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖的含量胭脂红、刚果红与壳聚糖在B-R缓冲溶液体系中结合,能引起溶液的共振瑞利散射(RRS)显著增强。考察了适宜的结合条件、影响因素以及共振瑞利散射与壳聚糖浓度的关系,发现一定浓度的壳聚糖与散射增强(ΔI)成正比。据此,建立了壳聚糖含量的测定的新方法,且方法的灵敏度较高,其中壳聚糖-胭脂红体系检测限0.019μg/mL,刚果红-壳聚糖体系检测限0.044μg/mL。胭脂红作探针的共振瑞利散射法在低浓度时不受壳聚糖分子量的影响。刚果红作探针的共振瑞利散射法不受壳聚糖分子量的影响。用于现有保健药品中壳聚糖和壳聚糖负载镧除氟后水样中壳聚糖的定量分析,结果令人满意。2、水溶性苯胺蓝、萘酚绿b作探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖的含量在弱酸性条件下,考察了壳聚糖与水溶性苯胺蓝、萘酚绿b的结合情况,建立了两种水浴条件下大大增强壳聚糖-染料离子缔合物共振瑞利散射强度的新方法。结果显示在适宜的反应条件下,水溶性苯胺蓝、萘酚绿b与壳聚结合形成离子缔合物,能引起溶液的共振瑞利散射(rrs)显著增强。壳聚糖-水溶性苯胺蓝体系在0.01~3.5μg/ml范围内与壳聚糖浓度呈线性关系,其检测限6.94ng/ml。壳聚糖-萘酚绿b体系在0.01~5.5mg/ml范围内与壳聚糖浓度呈线性关系,其检测限8.87ng/ml。更为重要的是,本文研究了壳聚糖分子量对测定结果准确性的影响,发现这两种方法均不受壳聚糖分子量的影响。水溶性苯胺蓝、萘酚绿b作探针的共振瑞利散射法是两种优越的检测方法,有简单、高灵敏度、准确性好的特点。3、壳聚糖-活性红4缔合体系的荧光猝灭与共振瑞利散射光谱研究及其在壳聚糖定量分析中的应用在弱酸性b-r缓冲体系中,壳聚糖对活性红4存在荧光猝灭作用,在λex/λem=285nm/341nm波长处,0.050~2.00μg/ml的浓度范围内,其荧光猝灭程度与壳聚糖浓度呈良好的线性关系。线性方程为:Δf=68.78c+2.648(c,μg/ml),r2=0.9992,检出限为0.039μg/ml。在相同的介质环境下,壳聚糖-活性红4离子缔合体系于λ=342nm有共振瑞利散射特征峰,在0.050~6.00μg/ml的浓度范围内,线性方程为:Δi=681.31c+114.95(c,μg/ml),r2=0.9991,检测限0.033μg/ml。据此,建立了以活性红4为探针定量分析壳聚糖的两种新方法:荧光猝灭法和共振瑞利散射法。同时,将两种方法就壳聚糖分子量对测定结果准确性的影响进行了研究。将两种新方法应用于实际样品的定量检测,测定结果基本一致,且回收率结果令人满意。4、氮气保护下酸水解结合分光光度法、hplc法测定壳聚糖含量本研究以壳聚糖水解液中氨基葡萄糖的产率为指标,在氮气保护的环境下对壳聚糖水解条件进行优化,优选最佳水解条件。tlc结果显示氮气保护下酸水解壳聚糖的最终产物为氨基葡萄糖,且水解时间越长,其产率越高。UV-Vis法测定结果显示,在100℃6 mol/L的HCl中水解54h水解产率更高。比较UV-Vis法和HPLC法对氨基葡萄糖的测定结果,显示HPLC法壳聚糖含量测定结果明显低于UV-Vis法,这可能与HPLC测定的专一性和壳聚糖HCl水解的不完全性有关。结论对比与壳聚糖结合的5种染料,5种染料均是带有多个-SO3-基团和多个刚性平面结构;5种共振瑞利散射法测定样品结果基本一致;活性红4共振瑞利散射法和荧光猝灭法测定样品时所得结果基本一致;提出两种消除壳聚糖分子量影响的方法;比较了HPLC法和紫外分光光度法测定水解后氨基葡萄糖含量,发现HPLC法测得结果偏低,反映出壳聚糖水解尚不彻底,水解方法还有待进一步研究。
【关键词】：壳聚糖 共振瑞利散射法 荧光猝灭法 高效液相色谱法 测定
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-17
• 第一章 胭脂红、刚果红作探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖的含量17-28
• 1 材料与方法17-18
• 1.1 仪器与试剂17-18
• 1.2 实验方法18
• 2 结果与分析18-25
• 2.1 光谱分析18-19
• 2.2 实验条件优化19-21
• 2.2.1 缓冲溶液19
• 2.2.2 pH的选择19-20
• 2.2.3 染料浓度的选择20
• 2.2.4 缓冲溶液的用量20-21
• 2.2.5 加入次序的影响21
• 2.2.6 反应时间和稳定时间21
• 2.2.7 离子强度的影响21
• 2.3 方法灵敏度21-23
• 2.3.1 线性关系与检出限21-22
• 2.3.2 壳聚糖分子量的影响22
• 2.3.3 在低浓度下测定模拟壳聚糖样品的含量22-23
• 2.4 共存物质的影响23-24
• 2.5 样品含量测定及加标回收率实验24-25
• 2.5.1 样品预处理24
• 2.5.2 实际样品测定及加标回收率实验24-25
• 3 共振瑞利散射增强的原因25-27
• 3.1 离子缔合物形成使散射分子团变大25-26
• 3.2 离子缔合物散射位于吸收带上使散射增强26-27
• 3.3 离子缔合物疏水性增强27
• 4 小结27-28
• 第二章 水溶性苯胺蓝（AB）、萘酚绿B(NGB)作探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖的含量28-42
• 1 材料与方法28-29
• 1.1 仪器与试剂28
• 1.2 实验方法28-29
• 2 结果与分析29-37
• 2.1 光谱分析29-30
• 2.2 实验条件优化30-33
• 2.2.1 缓冲溶液30
• 2.2.2 pH的选择及缓冲用量30-31
• 2.2.3 染料浓度31-32
• 2.2.4 温度的影响32-33
• 2.2.5 反应时间和稳定时间33
• 2.2.6 加入次序的影响33
• 2.2.7 离子强度的影响33
• 2.3 方法灵敏度33-34
• 2.3.1 线性关系与检出限33-34
• 2.3.2 分子量的影响34
• 2.4 方法选择性34-36
• 2.5 样品含量测定及加标回收率实验36-37
• 2.5.1 样品预处理36
• 2.5.2 样品含量测定及加标回收率实验36-37
• 3 机制讨论37-41
• 3.1 CTS-AB缔合机制讨论37-39
• 3.1.1 CTS-AB离子缔合物光谱分析37-38
• 3.1.2 CTS-AB离子缔合38-39
• 3.2 CTS-NGB缔合机制讨论39-41
• 3.2.1 CTS-NGB离子缔合机制39-40
• 3.2.2 CTS-AB离子缔合物光谱分析40-41
• 4 小结41-42
• 第三章 壳聚糖-活性红4缔合体系的荧光猝灭与共振瑞利散射光谱研究及其在壳聚糖定量分析中的应用42-53
• 1 材料与方法42-43
• 1.1 仪器与试剂42
• 1.2 方法42-43
• 1.2.1 荧光猝灭法42
• 1.2.2 共振瑞利散射法42-43
• 2 结果与分析43-52
• 2.1 光谱分析43-44
• 2.2 荧光光谱44
• 2.3 荧光猝灭方式44-45
• 2.4 共振瑞利散射图谱45-46
• 2.5 实验条件优化46-47
• 2.5.1 缓冲溶液及pH的选择46-47
• 2.5.2 活性红4溶液浓度的选择47
• 2.5.3 缓冲溶液用量的选择47
• 2.5.4 反应时间和稳定时间47
• 2.6 线性关系与检出限47-48
• 2.7 共存物质干扰48-49
• 2.8 壳聚糖分子量的影响49-51
• 2.8.1 荧光猝灭法49-50
• 2.8.2 共振瑞利散射法50-51
• 2.9 样品分析51-52
• 2.9.1 样品预处理51
• 2.9.2 样品含量测定及精密度实验、加标回收率实验51-52
• 3 小结52-53
• 第四章 氮气保护下酸水解结合分光光度法、HPLC法测定壳聚糖含量53-64
• 1 材料与仪器54-55
• 1.1 实验仪器54-55
• 2 实验方法55-56
• 2.1 溶液的配制55
• 2.2 壳聚糖水解方法55-56
• 2.3 氨基葡萄糖含量的测定方法56
• 2.3.1 紫外分光光度法（乙酰丙酮法）56
• 2.3.2 高效液相色谱法（衍生化法）56
• 2.3.3 壳聚糖水解液中氨基葡萄糖产率的计算方法56
• 3 结果与讨论56-63
• 3.1 壳聚糖水解生成氨基葡萄糖的验证56-57
• 3.2 壳聚糖水解条件优化57-61
• 3.2.1 盐酸和混合酸水解产率的比较57
• 3.2.2 不同反应温度条件下水解产率的比较57-58
• 3.2.3 不同盐酸浓度条件下水解产率的比较58-59
• 3.2.4 不同固液比条件下水解产率的比较59-60
• 3.2.5 不同反应时间条件下水解产率的比较60
• 3.2.6 100 ℃与 110 ℃不同反应时间水解产率的比较60-61
• 3.3 高效液相色谱法测定壳聚糖水解液GAH含量61-63
• 3.3.1 高效液相色谱法分析条件61
• 3.3.2 标准曲线绘制61-62
• 3.3.3 壳聚糖水解液的处理62-63
• 3.3.4 比较紫外分光光度法和高效液相色谱法测定壳聚糖含量63
• 4 小结63-64
• 结论与展望64-65
• 参考文献65-72
• 综述72-82
• 参考文献77-82
• 攻读硕士期间已发表论文和专利82-83
• 致谢83

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