基于RNAi研究氟对TGF-β信号通路的影响

发布时间：2017-08-12 05:27

  本文关键词：基于RNAi研究氟对TGF-β信号通路的影响

  更多相关文章： RNAi 支持细胞 TGF-β1 Smad2 Smad4 Smad6 Smad7 白介素-6 肿瘤坏死因子-α

【摘要】：[目的]本论文通过体外分离培养小鼠睾丸支持细胞,构建siRNA抑制的支持细胞TGF-β1模型,并在此基础上染氟,检测相关基因和蛋白的表达情况,探讨TGF-β信号通路在氟影响支持细胞免疫豁免功能中的调节作用机理。[方法]本试验建立siRNA抑制的支持细胞TGF-β1模型,运用qRT-PCR和Western Blot技术分别检测转染后的TGF-β1mRNA和蛋白,在验证成功的基础上再进行染氟处理,应用qRT-PCR和ELISA分别检测TGF-β1、Smad2、Smad4、 Smad6和Smad7mRNA以及支持细胞分泌的免疫相关蛋白白介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达情况。[结果](1)支持细胞培养鉴定结果：通过HE和姬姆萨染色,观察支持细胞的形态和生长状况。进行细胞计数发现细胞纯度达90%,细胞活性良好,可以用于进行模型建立。(2) siRNA最佳转染浓度的筛选：用不同浓度(20、30、50、100nM)的荧光标记的FAM-siRNA转染支持细胞,根据绿色荧光强弱筛选siRNA的最佳转染浓度,确定50nM选为siRNA的最佳转染浓度。(3) si-TGF-β1有效干扰序列的筛选：三种si-TGF-β1采用50nnM的浓度转染支持细胞,检测TGF-β1mRNA和蛋白的表达量,结果表明,siRNAl(si-TGF-β1-1)组和siRNA2 (si-TGF-β1-2)组对小鼠睾丸SCs蛋白TGF-β1的表达较空白对照组明显降低,其中si-RNA1组的差异极显著。(4) qRT-PCR结果：各试验组TGF-β1, Smad2, Smad4, Smad6和Smad7的mRNA表达量和对照组相比没有统计学意义,但都表现为降低的趋势。(5) ELISA:结果显示,IL-6蛋白表达水平在10-4M(mol/L)NaF和10-3M(mol/L)NaF两组中与对照组相比差异显著(**P0.01);与对照组相比,各处理组TNF-α的蛋白表达水平呈现降低的趋势,但差异不显著。[结论]TGF-β信号通路在氟对睾丸支持细胞免疫豁免功能影响中起到了一定调控作用，可能是通过TGF-β超家族其它成员(TGF-β1除外)、Smad蛋白家族以及免疫相关蛋白IL-6和TNF-α实现的。
【关键词】：RNAi 支持细胞 TGF-β1 Smad2 Smad4 Smad6 Smad7 白介素-6 肿瘤坏死因子-α
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要6-7
• 前言7-9
• 1 文献综述9-17
• 1.1 小鼠睾丸支持细胞分离培养及其生物学功能研究进展9-11
• 1.2 转化生长因子-β(TGF-β)超家族与Smad蛋白家族11-13
• 1.3 RNAi与TGF-β113-17
• 2 试验材料17-18
• 2.1 试验动物细胞17
• 2.2 主要试剂与耗材17
• 2.3 主要仪器设备17-18
• 3 试验方法18-24
• 3.1 试验模型的建立18-21
• 3.2 氟对siRNA抑制的小鼠睾丸SCs TGF-β1信号通路相关基因mRNA表达的检测21-24
• 3.3 应用ELISA检测氟对siRNA抑制的小鼠睾丸SCs免疫相关蛋白表达的影响24
• 3.4 试验数据统计与分析24
• 4 试验结果24-30
• 4.1 睾丸SCs分离培养及染色结果24-25
• 4.2 siRNA最佳转染浓度的筛选结果25-26
• 4.3 TGF-β1有效干扰序列的筛选结果26-28
• 4.4 氟对siRNA抑制的小鼠睾丸SCs TGF-β1信号通路相关基因mRNA表达的影响28-29
• 4.5 氟对siRNA抑制的小鼠睾丸SCs免疫相关蛋白表达影响的检测结果29-30
• 5 分析与讨论30-37
• 5.1 试验模型的建立30-32
• 5.2 氟对siRNA抑制的小鼠睾丸SCs TGF-β1信号通路相关基因mRNA表达的影响32-34
• 5.3 氟对siRNA抑制的小鼠睾丸SCs免疫相关蛋白表达的影响34-37
• 全文结论37-38
• 英文缩略词表38-40
• 参考文献40-46
• Abstract46-48
• 致谢48

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本文编号：659973