醋酸铅对体外培养小鼠睾丸间质细胞的毒性作用及凋亡机理的研究

发布时间：2017-08-15 01:18

  本文关键词：醋酸铅对体外培养小鼠睾丸间质细胞的毒性作用及凋亡机理的研究

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【摘要】：随着环境铅污染和职业铅暴露的日趋严重,铅对人类和动物的生殖毒性倍受关注,但铅的生殖毒性机制还不很清楚。睾丸间质细胞作为生精细胞的支架,可为生精细胞提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白为生精细胞提供高浓度的雄激素环境,并具备一定的吞噬功能等,是体内一种非常重要的雄性生殖细胞。因此,在本研究中,选用小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞)为研究对象,探讨铅对雄性动物生殖细胞的损伤作用及机制,为进一步研究开发新型铅特效解毒药提供试验基础和理论依据,并为防治由重金属引发的畜禽繁殖机能障碍提供新的切入点。 研究目的：以体外培养TM3细胞为模型,观察碱式醋酸铅对其凋亡的影响,进而探索凋亡死亡受体途径的机制。 研究方法：体外培养小鼠睾丸间质细胞,胰酶消化传代后,待细胞密度达到80%,将细胞分为四组,分别加入0,2,10,50μmol/L的醋酸铅染毒TM3细胞,作用24h后,采用MTT法检测醋酸铅对细胞增殖的影响；用氮蓝四唑(NBT)显色法检测SOD活性变化,用硫代巴比妥酸法测定细胞中MDA的含量,间接法检测细胞中GSH-Px活力,ABTS法检测总抗氧化能力即T-AOC;Hoechest33258和Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；Westernblot检测Caspase-8,FAS,FASI蛋白含量,以及Caspase-8阻断剂对细胞凋亡的抑制作用。 结果：TM3细胞在36℃、5%CO2环境下生长良好,12-36h为细胞对数生长期。醋酸铅抑制TM3细胞增殖；试验所选浓度2,10,50μM醋酸铅均显著降低抗氧化酶SOD、GSH-Px活性以及总抗氧化能力T-AOC,升高MDA的含量从而引起细胞氧化损伤；研究表明醋酸铅诱导细胞凋亡,最高细胞凋亡率可达33.87%,且通过死亡受体途径的FAS/FAS-L途径诱导TM3细胞凋亡。主要表现为：醋酸铅组的FAS, FAS-L, Caspase-8蛋白含量与对照组相比显著增多,以及Caspase-8抑制剂(C21H34N4O10)显著抑制醋酸铅所诱导的TM3细胞凋亡。 结论：醋酸铅对TM3细胞的毒性作用,主要是通过脂质过氧化作用引起细胞的氧化损伤,诱导细胞凋亡而实现的,FAS/FAS-L介导的死亡受体信号转导通路在调控TM3细胞凋亡中起着重要作用。
【关键词】：醋酸铅 小鼠 睾丸间质细胞 氧化损伤 细胞凋亡 死亡受体途径
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 致谢4-7
• 附录7-8
• 摘要8-9
• 文献综述9-15
• 1 选题目的及意义9-10
• 2 铅在人体的吸收、分布和代谢10
• 2.1 铅的吸收10
• 2.2 铅的分布10
• 2.3 铅的排泄10
• 3 铅的毒性作用10-12
• 3.1 铅对生殖的毒性作用10-11
• 3.2 铅对雄性生殖毒理可能机制11-12
• 3.3 铅对细胞凋亡的影响12
• 4 细胞凋亡12-13
• 4.1 细胞凋亡的特征12-13
• 4.2 细胞凋亡死亡受体通路13
• 5 睾丸间质细胞13-15
• 第一部分 醋酸铅对TM_3细胞的毒性作用15-33
• 1 材料与方法15-20
• 1.1 主要试剂与仪器15-17
• 1.1.1 试验材料15
• 1.1.2 主要试剂15-16
• 1.1.3 主要仪器16-17
• 1.1.4 主要试剂配制17
• 1.2 试验方法17-20
• 1.2.1 细胞培养17
• 1.2.2 MTT法检测细胞活力17
• 1.2.3 细胞染毒及分组17
• 1.2.4 细胞内总蛋白提取17-18
• 1.2.5 总蛋白含量的测定18
• 1.2.6 SOD、MDA及GSH-Px、T-AOC的测定18-20
• 1.2.7 Hechst33258凋亡检测20
• 1.2.8 Annexin-FITC/PI双染20
• 1.3 统计学分析20
• 2 结果与分析20-31
• 2.1 正常TM_3细胞的细胞形态20-21
• 2.2 醋酸铅对TM_3细胞的细胞毒性21-22
• 2.3 细胞中T-SOD、MDA、GSH-Px及T-AOC的测定22-26
• 2.3.1 T-SOD活性的测定22-23
• 2.3.2 MDA含量的测定23-24
• 2.3.3 GSH-Px活力的测定24-25
• 2.3.4 T-AOC含量的测定25-26
• 2.4 Hoechst 33258对细胞凋亡的检测26-28
• 2.6 Annexin V-FITC/PI双染色法检测TM_3细胞凋亡28-31
• 3 讨论31-33
• 第二部分 醋酸铅诱导TM3细胞凋亡机理的研究33-47
• 1 材料与方法33-38
• 1.1 主要试剂与仪器33-36
• 1.1.1 试验材料33
• 1.1.2 主要试剂33-34
• 1.1.3 主要仪器34-35
• 1.1.4 主要试剂配制35-36
• 1.2 试验方法36-38
• 1.2.1 Western blot检测Caspase-8,FAS,FAS-L蛋白含量36-37
• 1.2.2 Annexin-FITC/PI双染检测Caspase-8抑制剂对醋酸铅诱导TM_3细胞凋亡的影响37-38
• 1.3 统计学分析38
• 2 结果与分析38-44
• 2.1 Western blot检测Caspase-8、FAS、FAS-L蛋白含量38-42
• 2.1.1 Caspase-8蛋白含量的检测38-39
• 2.1.2 FAS蛋白含量的检测39-40
• 2.1.3 FAS-L蛋白含量的检测40-42
• 2.2 Annexin-FITC/PI双染检测Caspase-8抑制剂对醋酸铅诱导TM_3细胞凋亡的影响42-44
• 3 讨论44-47
• 参考文献47-51
• Abstract51-53
• 作者简介53

【参考文献】

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本文编号：675631