鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷变异株的构建及spvB、spvC基因对中毒症状、免疫功能的影响

发布时间：2017-08-18 07:31

  本文关键词：鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷变异株的构建及spvB、spvC基因对中毒症状、免疫功能的影响

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【摘要】：目的:实验组前期已构建鼠伤寒沙门菌spvB/spvC基因缺陷株,故本研究仅构建鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷株,并将野生菌株与这三株缺陷变异株感染小鼠,观察分析spvB/spvC基因对中毒症状、免疫调节功能的影响。为研究鼠伤寒沙门菌spvB/spvC毒力基因的致病机制提供理论和实验依据,并为后续细胞实验进一步研究该基因的功能及疫苗的制备提供工具和手段。方法:1.同源重组法制备鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷株。在GeneBank数据库中查出鼠伤寒沙门菌毒力基因spv序列(包括spvABCD),给spvB、spvC设计两对特异性引物,并在引物的5’末端加上酶切位点,PCR法扩增spvB基因上游及spvC基因下游的核苷酸片段后,连接至自杀质粒pCVD442(pCVD442-ΔspvB.spvC)。再将pCVD442-ΔspvB.spvC入感受态细菌SM10λpir内,按接合转移法使pCVD442-ΔspvB.spvC导入野生型鼠伤寒沙门菌211(spvB+.spvC+)中,随后蔗糖诱导同源重组。用PCR扩增来观察重组情况,将稳定的完全重组株认为是spvB.spvC基因共同缺陷变异株,并送基因测序鉴定。2.沙门菌spvB/spvC基因对中毒症状、免疫调节功能影响的研究。所有BALB/c小鼠均给予自由进食、饮水,室温(20℃-22℃),湿度(50%-55%)饲养。随机分为PBS组、野生型沙门菌211(Samonella typhimurium,STM.211)组、敲除spvB基因的沙门菌(STM.211-ΔspvB)组、敲除spvC基因的沙门菌(STM.211-Δspv C)组和同时敲除spv B.spvC基因的沙门菌(STM.211-ΔspvB.spvC)组,每组25只。PBS组经腹腔注射(intraperitoneal,i.p.)0.2ml PBS,其余各组分别注射0.2ml 105CFU的STM.211、STM.211-ΔspvB、STM.211-ΔspvC、STM.211-ΔspvB.spvC。造模完成后观察小鼠精神状态、运动情况、腹泻、体重、毛发改变等感染中毒症状,于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d,每组随机取5只小鼠摘眼球取血,用ELISA法测定血清IL-10、IL-12、IFN-γ水平;并分离小鼠肝、脾,观察靶器官大体观及显微镜下的病理改变。结果:1.成功构建了稳定的鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷株(STM.211-ΔspvB.spvC),PCR及测序分析证实spvB.spvC基因共同缺陷株中编码区有1965个碱基缺失。2.BALB/c小鼠在感染沙门菌后第1天不同程度的出现聚集蜷缩、运动减少、精神萎靡,毛发疏松,部分小鼠出现激惹症状,第3-5天时症状最明显,但均无腹泻症状。STM.211、STM.211-ΔspvB和STM.211-ΔspvC组的中毒症状明显较PBS组严重,STM.211-ΔspvB.spvC组与PBS组间无明显差异;沙门菌感染后,IFN-γ和IL-12分泌量显著增高,而IL-10升高的程度较低,产生以Th1优势应答为主的免疫反应,但不同菌株感染组间细胞因子分泌存在差异,STM.211组、STM.211-ΔspvB组、STM.211-ΔspvC组的IFN-γ和IL-12分泌量均显著低于STM.211-ΔspvB.spvC组(p0.05),而IL-10的分泌量明显高于STM.211-ΔspvB.spvC组(p0.05);STM.211组、STM.211-ΔspvB组、STM.211-Δspv C组间差异无统计学意义(p0.05)。结论:1.运用自杀质粒介导同源重组法成功构建鼠伤寒沙门菌spvB.spv C基因共同缺陷变异株;并为后续细胞实验进一步研究该基因的功能及疫苗的制备提供工具和手段。2.spvB/spvC基因相对抑制TH1细胞因子IFN-γ和IL-12的分泌,促进TH2细胞因子IL-10的分泌,使免疫应答向TH2方向偏移,出现TH1/TH2漂移。可见,spvB/spvC基因具有转换不同免疫应答类型的功能,从而有利于病原菌抵抗和逃避宿主的免疫防御,加重感染结局。
【关键词】：鼠伤寒沙门菌 spvB spvC 基因敲除 免疫应答
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R155.3
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 前言11-13
• 第一章 鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷株的构建13-25
• 1 材料与方法13-20
• 1.1 实验材料13-15
• 1.1.1 菌株和质粒13
• 1.1.2 主要试剂13-14
• 1.1.3 培养基及液体试剂配制14
• 1.1.4 主要仪器14-15
• 1.2 方法15-20
• 1.2.1 PCR引物设计及合成15
• 1.2.2 spvB基因上游片段、spvC基因下游片段的获取15-17
• 1.2.3 重组自杀质粒的构建17-19
• 1.2.4 鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷株的制备19-20
• 2 结果20-22
• 2.1 spvB基因上游和spvC基因下游片段的扩增20
• 2.2 spvB.spvC共同缺陷核苷酸的克隆20-21
• 2.3 spvB.spvC共同缺陷核苷酸克隆至沙门菌21
• 2.4 突变株的诱导、筛选及鉴定21-22
• 3 讨论22-25
• 第二章 spvB/spvC基因对免疫功能、靶器官病理改变的影响25-37
• 1 材料与方法25-29
• 1.1 实验材料25-27
• 1.1.1 细菌25-26
• 1.1.2 动物26
• 1.1.3 主要试剂、设备及器材:26-27
• 1.2 实验方法27-28
• 1.2.1 模型建立27
• 1.2.2 小鼠肝、脾脏器的病理切片27-28
• 1.2.3 ELISA法检测血清细胞因子28
• 1.3 数据分析28-29
• 2 结果29-34
• 2.1 感染后小鼠的感染中毒症状29
• 2.2 小鼠肝脏和脾脏的病理变化29-31
• 2.3 小鼠血清IL-10、IL-12和IFN-γ 水平检测31-34
• 3 讨论34-36
• 4 小结36-37
• 致谢37-38
• 参考文献38-43
• 攻读学位期间公开发表的论文43
• 本课题所获的基金资助43-44
• 综述44-52
• 参考文献49-52

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1 刘晓艳;鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷变异株的构建及spvB、spvC基因对中毒症状、免疫功能的影响[D];南昌大学医学院;2015年

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本文编号：693363