纳米氧化铜对人肝癌细胞HepG2细胞毒性及其机理研究

发布时间：2017-08-20 12:24

  本文关键词：纳米氧化铜对人肝癌细胞HepG2细胞毒性及其机理研究

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【摘要】：伴随纳米科技的迅猛发展,多种纳米材料被广泛应用,逐步进入到周围环境及生命体中,纳米材料的生物安全性及生态毒理学效应研究逐渐成为研究关注的热点。纳米氧化铜(CuO NPs)因具有良好的杀菌性、催化特性和热稳定性,而被广泛应用于涂料、废水处理、杀菌以及生物医用陶瓷材料等领域。细胞作为机体基本的结构与功能单位,其试验周期短、特异性高、易于培养,应用于揭示外来物质的致毒机理。本文以人肝癌细胞(HepG2)作为受试对象,系统探究了CuO NPs对HepG2细胞的毒性作用及分子机理。初步获得了以下几个结论：1.不同浓度CuO NPs对HepG2细胞的毒性效应研究结果显示,CuO NPs16h的IC50为8mg/L,同时随处理时间的增长,细胞活性明显降低。说明CuO NPs可抑制细胞的生长和增殖,具有细胞毒性,呈时间—剂量依赖效应。2.为了进一步明确CuO NPs对Hep(G2细胞的毒性作用机理,研究了不同浓度C uO NPs对HepG2细胞脂质过氧化损伤、蛋白质羰基化、DNA损伤以及细胞内活性氧(ROS)含量水平的影响。结果表明,HepG2细胞暴露于CuO NPs后,脂质过氧化(MDA)水平及蛋白质羰基化(PC)水平随CuO NPs浓度的增加而逐渐增大。CuO NPs可导致DNA彗尾的迁移距离显著上升,说明其诱导细胞产生DNA断裂损伤；CuO NPs可诱导DNA产生碱基修饰,从而生成8-OHdG,产生DNA氧化损伤,上述结果说明CuO NPs具有遗传毒性。同时,细胞内ROS水平呈爆发式增长。本研究利用ROS清除剂NAC进行反向验证实验,结果显示,NAC可清除过量的ROS从而对细胞内生物大分子起到保护作用。结果证实了活性氧(ROS)是CuO NPs引起HepG2细胞损伤作用的关键因素。3.利用流式细胞术进行细胞周期的定量检测,结果显示CuO NPs浓度的增加使得HepG2细胞周期阻滞更加显著,细胞周期相关基因CDK表达量随CuONPs浓度增加而上升,cyclin表达量随CuO NPs浓度增加而下降,证实HepG2细胞周期被阳滞干S期。采用流式细胞仪双染色法检测显示CuO NPs可剂量依赖性地诱导HepG2细胞凋亡。细胞内过量的ROS可造成线粒体膜位电势(Δφpm)下降,引起线粒体去极化。通过对细胞凋亡相关基因表达量的检测分析发现,CuO NPs处理后的HepG2细胞的Caspase-3及C aspase-9两个基因的表达量上升,提示由线粒体介导的Caspases活化级联形式是C uO NP s诱导细胞发生凋亡的重要通路。上述结果表明,CuO NPs可以抑制HepG2细胞增殖,对细胞产生氧化损伤作用；同时CuO NPs可引起细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡,其机制与ROS诱导线粒体介导的细胞凋亡途径有关。
【关键词】：纳米氧化铜 HepG2细胞 活性氧(ROS) DNA损伤 蛋白质羰基化(PC) 脂质过氧化(MDA) 细胞凋亡 细胞周期阻滞
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第1章 绪论13-23
• 1.1 纳米材料简介13-18
• 1.1.1 纳米材料的分类13-15
• 1.1.1.1 碳NPs13-14
• 1.1.1.2 金属氧化物类NPs14
• 1.1.1.3 非金属氧化物NPs14
• 1.1.1.4 金属NPs14
• 1.1.1.5 量子点(QDs)14-15
• 1.1.2 纳米材料的特性15-16
• 1.1.2.1 小尺寸效应15
• 1.1.2.2 表面效应15
• 1.1.2.3 体积效应15-16
• 1.1.2.4 量子尺寸效应16
• 1.1.2.5 宏观量子隧道效应16
• 1.1.3 纳米材料的应用16-18
• 1.1.3.1 催化剂材料16-17
• 1.1.3.2 传感器材料17
• 1.1.3.3 生物医药领域的应用17-18
• 1.1.3.4 环保领域的应用18
• 1.2 纳米材料毒性研究进展18-20
• 1.2.1 纳米材料的抗菌活性18
• 1.2.2 纳米材料的植物毒性18-19
• 1.2.3 纳米材料的动物毒性19-20
• 1.2.4 纳米材料的细胞毒性20
• 1.3 研究背景、意义及技术路线20-23
• 1.3.1 研究背景20-21
• 1.3.2 研究目的和意义21-22
• 1.3.3 研究技术路线22-23
• 第2章 CuO NPs的表征及分散于培养基中的基本性质23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 实验材料23-24
• 2.3 实验方法24-25
• 2.3.1 悬浮液配制24
• 2.3.2 粒径测定24
• 2.3.3 表面积测定24
• 2.3.4 XRD表征24
• 2.3.5 CuO NPs悬浮液Zeta电位的测定24
• 2.3.6 CuO NPs释放Cu~(2+)含量测定24-25
• 2.4 实验结果25-28
• 2.4.1 纳米CuO的基本理化性质25-26
• 2.4.2 纳米CuO在培养基及水中的性质对比26-27
• 2.4.3 CuO NPs释放Cu~(2+)含量测定27-28
• 2.5 本章小结28-29
• 第3章 CuO NPs对HepG2细胞的损伤作用及致毒机理29-53
• 3.1 引言29-30
• 3.2 实验材料30-31
• 3.2.1 细胞株30
• 3.2.2 实验试剂30
• 3.2.3 溶液配制30-31
• 3.3 实验方法31-42
• 3.3.1 细胞培养31-32
• 3.3.2 CCK-8法检测细胞活性及IC_(50)的测定32-33
• 3.3.3 细胞内脂质过氧化物损伤(MDA)的测定33-36
• 3.3.4 细胞内蛋白质羰基化的测定36-37
• 3.3.5 细胞DNA氧化损伤检测37-41
• 3.3.5.1 单细胞凝胶电泳(SCGE)实验38-39
• 3.3.5.2 细胞内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)免疫组化分析39-41
• 3.3.6 细胞内活性氧类(ROS)的测定41
• 3.3.7 NAC对纳米CuO所致HepG2细胞损伤的保护作用41-42
• 3.4 实验结果42-49
• 3.4.1 CuO NPs抑制HepG2细胞增殖及NAC干预作用42-43
• 3.4.2 CuO NPs诱导HepG2细胞内MDA含量升高及NAC干预作用43-44
• 3.4.3 CuO NPs诱导HepG2细胞内PC含量升高及NAC干预作用44-45
• 3.4.4 CuO NPs诱导HepG2细胞DNA链断裂及NAC干预作用45-46
• 3.4.5 CuO NPs诱导HepG2细胞内8-OHdG含量升高及NAC干预作用46-47
• 3.4.6 CuO NPs诱导HepG2细胞内ROS水平升高及NAC干预作用47-49
• 3.5 讨论49-53
• 第4章 CuO NPs诱导HepG2细胞周期阻滞及细胞凋亡作用机制53-71
• 4.1 引言53-54
• 4.2 实验材料54
• 4.2.1 细胞株54
• 4.2.2 实验药品54
• 4.2.3 溶液配制54
• 4.3 实验方法54-62
• 4.3.1 细胞培养54-55
• 4.3.2 纳米CuO诱导HepG2细胞周期阻滞55-59
• 4.3.2.1 流式细胞术检测细胞周期阻滞55-56
• 4.3.2.2 细胞RNA的提取56
• 4.3.2.3 荧光定量PCR检测56-59
• 4.3.2.3.1 反转录第一链cDNA56-57
• 4.3.2.3.2 引物的设计57
• 4.3.2.3.3 Real-time PCR的反应体系57-58
• 4.3.2.3.4 Real-time PCR的反应程序58
• 4.3.2.3.5 结果分析58-59
• 4.3.3 纳米CuO诱导HepG2细胞凋亡59-62
• 4.3.3.1 JC-1染色检测线粒体膜位电势△φ_m59
• 4.3.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡59-61
• 4.3.3.3 细胞RNA的提取61
• 4.3.3.4 荧光定量PCR检测61-62
• 4.3.3.4.1 反转录第一条链cDNA61
• 4.3.3.4.2 引物的设计61-62
• 4.3.3.4.3 Real-time PCR的反应体系62
• 4.3.3.4.4 Real-time PCR的反应程序62
• 4.3.3.4.5 结果分析62
• 4.4 实验结果62-67
• 4.4.1 CuO NPs诱导HepG2细胞周期阻滞62-64
• 4.4.2 CuO NPs诱导HepG2细胞凋亡64-67
• 4.5 讨论67-71
• 第5章 结论、创新之处和研究展望71-74
• 5.1 主要结论71-73
• 5.1.1 活性氧(ROS)是CuO NPs引起HepG2细胞损伤作用的关键因素71-72
• 5.1.2 CuO NPs诱导HepG2细胞周期阻滞72
• 5.1.3 CuO NPs诱导HepG2细胞凋亡的途径是由线粒体所接到的Caspase途径72-73
• 5.2 创新之处73
• 5.3 研究展望73-74
• 参考文献74-87
• 致谢87-88
• 攻读硕士学位期间取得研究成果88-89
• 附录Ⅰ 文中主要缩略语中英文对照表89-91
• 附录Ⅱ 主要实验仪器与设备91

【共引文献】

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本文编号：706623