γ-氨基丁酸对RIN-m5f细胞的保护作用及机制探究

发布时间：2017-08-21 02:12

  本文关键词：γ-氨基丁酸对RIN-m5f细胞的保护作用及机制探究

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【摘要】：目的：氧化应激被认为是糖尿病发生和发展过程中的一种主要风险因素。GABA是中枢神经系统中一种主要的抑制性神经递质。研究证实，胰岛β细胞分泌大量GABA，，对维护胰岛β细胞氧化还原稳态和胰岛素分泌功能具有重要调节作用，但其具体作用机制尚不明确。本研究拟建立高糖（G）和H2O2氧化损伤RIN-m5f细胞模型，以探讨GABA对胰岛β细胞抗氧化调节作用及其作用机制。 方法：分别采用11mM、22mM、44mM G孵育RIN-m5f细胞48h，以及10μM、50μM、100μM H2O2孵育1h建立体外氧化损伤细胞模型。GABA干预实验分为：对照组（11mM G）、损伤组（G/H2O2）、GABA组（G/H2O2+GABA）、硫辛酸组（G/H2O2+LA）。采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平；检测细胞氧化还原状态指标和胰岛素分泌水平；MTT法测定细胞存活率；流式细胞术检测细胞凋亡线粒体膜电位；RT-PCR法检测与抗氧化、抗凋亡和胰岛素分泌相关基因mRNA表达水平；Western blot法检测Nrf2和GSK-3β蛋白水平、p-GSK-3β（Ser9）和p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平。 结果：随着G和H2O2浓度的增加，胞内ROS和MDA水平显著提高（P0.05），且GAD1mRNA表达水平极显著下调（P0.01），细胞均出现不同程度的氧化损伤（P0.05）；添加100μM和200μM GABA可显著降低胞内ROS和MDA水平（P0.05），提高T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD活力，上调抗氧化及抗凋亡相关基因Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2mRNA表达水平（P0.05），提高细胞线粒体膜电位和存活率（P0.05）；此外，GABA可显著提高胰岛素合成相关基因（INS-2、Pdx-1、MafA、GK、GLUT2、Gabra2）mRNA表达水平（P0.05），促进胰岛素分泌释放；Western blot结果显示，GABA显著抑制氧化损伤细胞（44mM G和100μM H2O2）GSK-3β蛋白水平（P0.05），显著提高p-GSK-3β（Ser9）磷酸化水平和Nrf2核质比例（P0.05），但对p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平无显著性影响（P0.05）。 结论：GABA可显著增强氧化损伤（G和H2O2）RIN-m5f细胞抗氧化能力，提高细胞存活率和胰岛素合成分泌，具有抗凋亡作用；GABA可调节胞内GSK-3β/Nrf2通路相关基因mRNA表达水平，显著提高Nrf2核质比例，增强细胞抗氧化能力，其作用机制可能与提高p-GSK-3β (Ser9)磷酸化水平、降低GSK-3β蛋白水平有关；GABA抗氧化调节作用具有浓度依赖效应，即随着氧化损伤程度的增加，GABA需要量增加。
【关键词】：GABA 抗氧化 抗凋亡 胰岛素分泌 RIN-m5f细胞
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R151.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-5
• 中英文缩略语对照表5-6
• 目录6-8
• 一 引言8-17
• 1.1 糖尿病概述8-9
• 1.2 糖尿病与氧化应激9
• 1.2. 氧化应激概述9-12
• 1.2.2 氧化应激与糖尿病9-11
• 1.2.3 GSK-3β/Nrf2 信号通路与胰岛β细胞功能11-12
• 1.3 γ-氨基丁酸（Gamma-AminobutyricAcid，GABA）及其研究进展12-14
• 1.3.1 GABA 概述12-13
• 1.3.2 GABA 与胰腺的相关研究13-14
• 1.3.3 GABA 抗氧化调节作用14
• 1.4 立题意义及研究内容14-17
• 二 材料与方法17-24
• 2.1 材料与仪器17
• 2.1.1 主要实验原料及试剂17
• 2.1.2 实验仪器17
• 2.2 实验方法17-24
• 2.2.1 细胞培养相关溶液配制17-18
• 2.2.2 RIN-m5f 细胞培养18
• 2.2.3 H_2O_2氧化损伤模型和高糖氧化损伤模型的建立18
• 2.2.4 GABA 对 H_2O_2和高糖诱导氧化损伤 RIN-m5f 细胞保护浓度的选择18-19
• 2.2.5 MTT 法检测细胞存活率19
• 2.2.6 DCFH-DA 荧光探针法检测细胞内自由基 ROS 水平19
• 2.2.7 氧化还原指标（抗氧化酶活力和 MDA 含量）的测定19
• 2.2.8 测定细胞凋亡线粒体膜电位（△ψ）19
• 2.2.9 胰岛素分泌测定19-20
• 2.2.10 实时荧光定量 PCR 检测基因 mRNA 水平20-21
• 2.2.11 Western Blot 检测蛋白表达21-23
• 2.2.12 统计学处理23-24
• 三 结果与讨论24-48
• 3.1 高糖氧化损伤模型和 H_2O_2氧化损伤模型的建立24-25
• 3.1.1 高糖诱导 RIN-m5f 细胞氧化损伤模型的建立24
• 3.1.2 建立 RIN-m5f 细胞 H_2O_2氧化损伤模型24-25
• 3.2 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞的抗氧化调节作用研究25-30
• 3.2.1 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞 ROS 水平的影响25-26
• 3.2.2 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞氧化还原指标的影响26-29
• 3.2.3 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤RIN-m5f细胞抗氧化相关基因mRNA水平的影响29-30
• 3.3 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞的抗凋亡作用探究30-36
• 3.3.1 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞凋亡线粒体膜电位的影响31-32
• 3.3.2 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞存活率的影响32-34
• 3.3.3 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤RIN-m5f细胞凋亡相关基因mRNA水平的影响34-36
• 3.4 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞胰岛素分泌功能的影响36-40
• 3.4.1 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞胰岛素分泌量的影响36-37
• 3.4.2 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞与胰岛素分泌相关基因的影响37-40
• 3.5 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞保护通路的探究40-48
• 3.5.1 高糖和 H_2O_2氧化损伤对 GAD 的影响40-42
• 3.5.2 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞 Akt/GSK-3β通路相关基因的影响42-43
• 3.5.3 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞 GSK-3β蛋白表达及其磷酸化水平的影响43-46
• 3.5.6 GABA 对高糖和 H_2O_2氧化损伤 RIN-m5f 细胞 Nrf2 核质比的影响46-48
• 主要结论与展望48-49
• 主要结论48
• 展望48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-56
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：710209