重金属纳米镍致癌分子机制研究

发布时间：2017-08-21 05:34

  本文关键词：重金属纳米镍致癌分子机制研究

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【摘要】：目的：本研究采用小鼠上皮JB6细胞作为研究对象，通过体外试验来探索重金属纳米镍可能的致癌毒性机制并选用合适的抗氧化剂来抑制纳米镍的毒性。为纳米镍潜在致癌性的评价、防治和拮抗药物的开发提供科学依据。 方法：1、通过MTT试验来检测不同浓度纳米镍（0-10μg/cm2）对JB6细胞增殖的影响（即单纯纳米镍染毒组），以及加入浓度为10μM的没食子儿茶素没食子酸酯（-Epigallocatechin-3-gallate, EGCG）对经不同浓度纳米镍染毒后细胞增殖的影响（抗氧化剂组）。 2、使用流式细胞仪对处理后两组JB6细胞的细胞周期和细胞凋亡情况进行检测。 3、通过荧光探针染料对处理后的两组JB6细胞进行染色，并在激光共聚焦显微镜下观察细胞微丝结构和氧化应激水平的变化。 4、通过萤光色素酶试验来检测处理后两组JB6细胞中AP-1和NF-κB转录因子的表达情况。 5、通过蛋白印迹法检测处理后两组JB6细胞中MAPK信号通路相关蛋白的表达情况。 结果：1、细胞增殖试验结果显示：在经不同浓度纳米镍染毒24h后，细胞存活数目随染毒浓度的升高而逐渐减少，而EGCG可对染毒后的细胞起到一定的保护作用，尤其在7.5和10μg/cm2的纳米镍染毒浓度。 2、细胞凋亡和周期试验结果显示：纳米镍造成的细胞死亡主要以凋亡为主，且低浓度的纳米镍可以将JB6细胞阻滞在G0/G1期，而高浓度的镍纳米颗粒能将细胞阻滞在G2/M期。而EGCG对纳米镍造成的细胞凋亡具有一定保护作用且能将纳米镍染毒后的细胞维持在一个较高的G0/G1期比例。 3、经高浓度的纳米镍染毒（7.5、10μg/cm2）后，JB6细胞微丝的正常结构逐渐消失并围绕细胞核形成明显的致密束。EGCG能在一定程度上缓解纳米镍染毒造成的微丝结构破坏，但无法阻止微丝致密束的形成。 4、EGCG能明显降低纳米镍染毒后细胞内ROS和O2-水平。 5、纳米镍能够上调JB6细胞中Ap-1和NF-κB等转录因子的表达水平，而EGCG能起到抑制作用。 6、纳米镍能上调MAPK通路磷酸化的水平而抗氧化剂能降低该通路磷酸化水平的表达。 结论：1、纳米镍能抑制JB6细胞的增殖同时增加细胞凋亡；抗氧化剂EGCG能抑制纳米镍的毒性并对细胞起到保护作用。 2、低浓度纳米镍染毒后能促进细胞凋亡而高浓度可能会损伤细胞DNA，EGCG能对纳米镍引起的致癌性起到一定的抑制作用。 3、纳米镍对JB6细胞的毒性可能通过氧化应激损伤来实现，而EGCG能降低细胞内氧化应激水平。 4、纳米镍可能通过上调AP-1和NF-κB转录因子的水平来实现其致癌毒性，而抗氧化剂能在一定程度上拮抗该作用。 5、纳米镍通过上调MAPK细胞信号通路尤其是P38和ERK1/2的磷酸化水平来实现其致癌性，，而抗氧化剂能下调MAPK细胞信号通路的磷酸化水平从而起到保护作用。
【关键词】：纳米镍 JB6细胞 致癌性 没食子儿茶素没食子酸酯 MAPK信号通路
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-15
• 1 材料15-21
• 1.1 实验材料15
• 1.1.1 重金属纳米镍15
• 1.1.2 实验细胞株15
• 1.1.3 抗氧化剂材料15
• 1.2 实验试剂15-19
• 1.2.1 细胞培养相关试剂及配置15-16
• 1.2.2 实验及其他辅助试剂及配置16-19
• 1.3 主要实验仪器19-21
• 2 研究方法21-27
• 2.1 纳米材料的配置及物理特征检测21
• 2.2 细胞培养及处理21-22
• 2.2.1 细胞复苏21
• 2.2.2 细胞换液21
• 2.2.3 细胞传代21
• 2.2.4 细胞冻存21-22
• 2.3 MTT 实验22
• 2.4 细胞周期实验22-23
• 2.4.1 细胞接种及染毒22
• 2.4.2 细胞收集22-23
• 2.4.3 细胞固定及流式细胞仪检测23
• 2.5 细胞凋亡实验23
• 2.5.1 细胞接种及染毒23
• 2.5.2 细胞收集23
• 2.5.3 细胞处理及流式细胞仪检测23
• 2.6 细胞微丝结构观察实验23-24
• 2.6.1 准备爬片和接种染毒23
• 2.6.2 微丝荧光染色23-24
• 2.7 细胞自由基（ROS）生成状况观察实验24
• 2.7.1 准备爬片和接种染毒24
• 2.7.2 细胞自由基染色24
• 2.8 萤光色素酶检测基因（Luciferase 法）表达实验24
• 2.9 蛋白免疫印迹（West-blotting 法）实验24-26
• 2.9.1 蛋白提取24-25
• 2.9.2 BCA 法测定总蛋白质含量25
• 2.9.3 蛋白印迹实验25-26
• 2.10 统计数据分析26-27
• 3 实验结果27-41
• 3.1 纳米镍的物理特征27-28
• 3.2 单纯纳米镍染毒组和抗氧化剂组中 JB6 细胞生存率变化28-29
• 3.3 单纯纳米镍染毒组和抗氧化剂组中 JB6 细胞形态学观察29-31
• 3.4 单纯纳米镍染毒组和抗氧化剂组中 JB6 细胞周期变化31-33
• 3.5 单纯纳米镍染毒组和抗氧化剂组中 JB6 细胞凋亡变化33-35
• 3.6 单纯纳米镍染毒组和抗氧化剂组中 JB6 细胞微丝结构变化35-37
• 3.7 单纯纳米镍染毒组和抗氧化剂组自由基变化情况37
• 3.8 单纯纳米镍染毒组和抗氧化剂组萤光色素酶变化37-38
• 3.9 单纯纳米镍染毒组和加抗氧化剂组 MAPK 通路蛋白变化38-41
• 4 讨论41-45
• 4.1 单纯纳米镍和加抗氧化剂对 JB6 细胞的生存率、细胞周期、细胞凋亡等的影响41-42
• 4.2 单纯纳米镍和加抗氧化剂对 JB6 细胞内氧化应激及细胞骨架的影响42-43
• 4.3 单纯纳米镍和加抗氧化剂对 JB6 细胞中转录因子及 MAPK 通路蛋白的影响43-44
• 4.4 研究的展望和本研究的局限性44-45
• 5 结论45-46
• 6 参考文献46-52
• 7 附录A：综述52-62
• 参考文献58-62
• 8 附录 B：英文缩略词62-64
• 9 在学研究成果64-66
• 致谢66

【参考文献】

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1 刘红云;白伟;张智勇;胡友彪;赵宇亮;刘年庆;;纳米氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的影响[J];中国环境科学;2009年01期

2 黄琴琴;王永禄;李学明;;纳米载体材料毒理学效应及其作用机制研究进展[J];中国药房;2011年21期

本文编号：711147