甲基乙二醛诱导EA.hy926细胞线粒体膜通透性转换孔开放的机制

发布时间：2017-08-25 06:33

  本文关键词：甲基乙二醛诱导EA.hy926细胞线粒体膜通透性转换孔开放的机制

  更多相关文章： 甲基乙二醛 线粒体功能障碍 细胞凋亡 mPTP GSK3β

【摘要】：甲基乙二醛(Methylglyoxal,MGO)是一种内源性代谢的活性羰基化合物,易与蛋白质的氨基酸残基反应生成晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs),可以诱导细胞羰基应激和氧化应激,导致细胞损伤。MGO以及AGEs的积累在糖尿病血管并发症、肾病等疾病中起到关键作用,抑制MGO的细胞毒性对以上疾病的防控尤为重要。MGO的细胞毒性机制主要是AGEs-RAGE(AGEs receptor),促进活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,诱导线粒体损伤和细胞凋亡,但对于细胞凋亡的机制尚未详细阐述。线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放在线粒体依赖的细胞凋亡中起到关键,但MGO能否诱导mPTP及其机制尚不清楚。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)是目前调控mPTP的重要调节蛋白,被激活后可以诱导线粒体膜上的己糖激酶II(HexokinaseII,HKII)从线粒体脱离而引起mPTP开放。本研究将以EA.hy926细胞为模型,以线粒体膜通透性转换孔为靶点,从AGEs-RAGE、氧化应激阐述MGO引起的细胞毒性机制。结果如下:1.通过3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)、台盼蓝染色法检测MGO的细胞毒性,罗丹明123检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化、DCFH-DA探针检测ROS、线粒体基质肿胀、流式细胞仪检测细胞凋亡,探讨MGO引起细胞毒性的机制。结果显示随着MGO浓度的增加,细胞活力降低,细胞毒性增强,线粒体MMP降低、细胞ROS增加、线粒体基质肿胀、细胞凋亡,且都呈现浓度依赖效应。而且加入羰基捕获剂氨基胍(Aminoguanidine,AG)、活性氧抑制剂4-Hydroxy-TEMPO(TEMPOL)以及GSK3β抑制剂SB216763、LiCl,均可显著抑制MGO的这种作用。2.Westren blot检测细胞内非荧光AGEs羧甲基赖氨酸(N-ε-carboxymethyl-lysine,CML)及其受体RAGE、GSK3β激酶9位丝氨酸磷酸化的蛋白水平以及HKII在线粒体内的蛋白水平表达。结果显示随着MGO浓度的增加,CML、RAGE蛋白表达水平显著增加,而羰基捕获剂AG、活性氧抑制剂TEMPOL显著抑制MGO诱导的CML、RAGE蛋白表达水平的增加;相反,随着MGO浓度的增加,GSK3β激酶9位丝氨酸磷酸化蛋白表达水平显著减少,但此蛋白表达水平的减少可被AG、TEMPOL和GSK3β抑制剂SB216763显著抑制;0.5 mM和1 mM MGO引起线粒体内HKII蛋白水平表达显著减少,而羰基捕获剂AG、活性氧抑制剂TEMPOL以及GSK3β抑制剂SB216763和LiCl显著抑制MGO引起的线粒体内HKII蛋白水平表达显著减少。综上所述,MGO引起EA.hy926细胞毒性,其毒性机制可能与线粒体损伤、细胞凋亡相关。进一步实验证明MGO引起细胞凋亡的毒性机制与线粒体膜通透性转换孔有关,可能的机制是(1)MGO通过CML-RAGE通路激活GSK3β作用于线粒体膜通透性转换孔;(2)MGO诱导的氧化应激作用于GSK3β而诱导线粒体膜通透性改变;(3)MGO诱导的氧化应激直接调控mPTP。
【关键词】：甲基乙二醛 线粒体功能障碍 细胞凋亡 mPTP GSK3β
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-13
• 文献综述13-27
• 第一章 MGO细胞毒性机制的研究进展13-27
• 1.1 MGO的来源与代谢13-15
• 1.1.1 MGO体内和体外来源13
• 1.1.2 MGO的体内代谢途径13-15
• 1.2 MGO与羰基应激15-17
• 1.2.1 羰基应激的发生及其毒性作用15
• 1.2.2 AGEs的形成及其毒性作用15-16
• 1.2.3 MGO诱导羰基应激和AGEs的形成16-17
• 1.3 MGO与氧化应激17-19
• 1.3.1 氧化应激的产生及其毒性作用17-18
• 1.3.2 MGO诱导氧化应激导致细胞毒性18-19
• 1.3.2.1 MGO诱导一氧化氮合成酶产生氧化应激18
• 1.3.2.2 MGO通过MAPK信号通路产生氧化应激18
• 1.3.2.3 MGO激活MEK/ERK信号通路产生氧化应激18
• 1.3.2.4 MGO激活NADPH氧化酶产生氧化应激18
• 1.3.2.5 MGO通过AGEs/RAGE诱导氧化应激18-19
• 1.4 MGO与细胞凋亡19-20
• 1.4.1 细胞凋亡途径19
• 1.4.2 MGO诱导的细胞凋亡19-20
• 1.5 线粒体膜通透性转换孔(mPTP)与细胞凋亡20-24
• 1.5.1 mPTP的结构与功能20-23
• 1.5.1.1 mPTP的发现以及组成结构20-22
• 1.5.1.2 mPTP的生理功能22-23
• 1.5.2 mPTP开放与细胞凋亡23
• 1.5.3 mPTP开放的诱导因素23-24
• 1.6 糖原合酶激酶 3β 调控mPTP研究进展24-26
• 1.6.1 GSK3β 激酶活性及功能24
• 1.6.2 GSK3β 调节mPTP的机制24-26
• 1.7 研究假设26-27
• 试验研究27-48
• 第二章 甲基乙二醛诱导EA.hy926细胞线粒体功能障碍27-37
• 2.1 试验材料及仪器27-28
• 2.1.1 材料27
• 2.1.2 试验主要试剂及配制27-28
• 2.1.3 试验仪器28
• 2.2 试验方法28-31
• 2.2.1 EA.hy926细胞的培养28-29
• 2.2.1.1 EA.hy926细胞的复苏28-29
• 2.2.1.2 EA.hy926细胞的传代29
• 2.2.1.3 EA.hy926细胞的冻存29
• 2.2.2 细胞毒性的测定29-30
• 2.2.2.1 MTT法测定MGO对EA.hy926的细胞活力29
• 2.2.2.2 台盼蓝法检测细胞毒性29-30
• 2.2.3 罗丹明 123（Rh123）荧光探针法检测线粒体膜电位（MMP）30
• 2.2.4 线粒体肿胀检测30
• 2.2.4.1 线粒体提取及完整性鉴定30
• 2.2.4.2 线粒体肿胀检测30
• 2.2.5 DCFH-DA荧光探针法测定细胞内氧化应激水平30-31
• 2.2.6 细胞凋亡检测31
• 2.2.7 数据分析31
• 2.3 试验结果31-35
• 2.3.1 MGO对EA.hy926细胞毒性31-32
• 2.3.2 MGO对线粒体膜电位（MMP）的影响32
• 2.3.3 MGO诱导线粒体基质肿胀32-33
• 2.3.4 MGO诱导EA.hy926细胞产生氧化应激33-34
• 2.3.5 MGO诱导EA.hy926细胞凋亡34-35
• 2.4 讨论35-36
• 2.5 小结36-37
• 第三章 甲基乙二醛通过AGEs-RAGE/GSK3β 途径调节线粒体膜通透性转换孔（mPTP）37-48
• 3.1 材料37-38
• 3.1.1 主要试剂及配制37-38
• 3.1.2 试验仪器38
• 3.2 试验方法38-40
• 3.2.1 Western blot检测相关蛋白38-39
• 3.2.2.1 细胞全蛋白的提取38
• 3.2.2.2 线粒体蛋白提取38-39
• 3.2.2.3 Western blot检测蛋白39
• 3.2.2 MTT法测定三类抑制剂对MGO引起EA.hy926细胞毒性的影响39
• 3.2.3 罗丹明 123（Rh123）荧光探针法检测线粒体膜电位（MMP）39
• 3.2.4 线粒体肿胀检测39
• 3.2.5 DCFH-DA荧光探针法测定细胞内氧化应激水平39
• 3.2.6 细胞凋亡检测39-40
• 3.2.7 数据分析40
• 3.3 试验结果40-45
• 3.3.1 MGO对CML和RAGE蛋白表达的影响40
• 3.3.2 MGO对GSK3β 蛋白磷酸化的影响40-41
• 3.3.3 MGO对HKII结合线粒体的影响41
• 3.3.4 三类抑制剂对MGO引起的细胞活力、MMP、ROS的影响41-42
• 3.3.5 三类抑制剂对MGO引起细胞凋亡的影响42-43
• 3.3.6 三类抑制剂对MGO引起的CML和RAGE表达增加的作用43-44
• 3.3.7 三类抑制剂对MGO引起的HKII脱离线粒体的影响44
• 3.3.8 三类抑制剂对MGO引起GSK3β 磷酸化减少的影响44-45
• 3.4 讨论45-47
• 3.5 小结47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-59
• 缩略词59-61
• 致谢61-62
• 作者简介62

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 崔云鹏;朱凤林;陈兰;;线粒体膜通透性转运孔与缺血缺氧性脑损伤[J];中风与神经疾病杂志;2007年04期

2 辛星;裴晶晶;曾涛;谢克勤;朱振平;窦丹丹;赵盛;赵秀兰;;磷酸三邻甲苯酯对母鸡神经组织线粒体膜通透性的影响[J];环境与健康杂志;2009年08期

3 田秀君,郑德先,刘彦信;Multidomain蛋白对线粒体膜通透性的调控[J];承德医学院学报;2004年02期

4 孟文彤;线粒体膜通透性转运孔的研究进展[J];国外医学.输血及血液学分册;2001年02期

5 杨志敏;李昌平;;线粒体膜通透性转换孔与非酒精性脂肪肝病[J];西南军医;2010年02期

6 陈丹;石年;黄晓薇;刘琳琳;;溴氰菊酯对大鼠脑组织线粒体膜通透性和细胞色素C表达的影响[J];中华劳动卫生职业病杂志;2006年06期

7 李海涛;;抑制线粒体膜通透性转换孔开放对心力衰竭的影响[J];安徽医科大学学报;2013年10期

8 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前3条

1 蒋春笋;荣小辉;时庆德;聂金雷;张勇;陈;;运动延缓衰老的可能机理:活性氧生成对线粒体膜通透性转换的作用[A];2002年第9届全国运动医学学术会议论文摘要汇编[C];2002年

2 郭铭生;石达友;刘念;李鹏飞;潘家强;唐兆新;;黄曲霉毒素B_1对肉鸡肝线粒体膜通透性的影响[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会2009年学术研讨会论文集[C];2009年

3 刘念;石达友;郭铭生;李鹏飞;潘家强;唐兆新;;线粒体渗透转换孔在信号传导中的调控[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会2009年学术研讨会论文集[C];2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 穆颍颍;甲基乙二醛诱导EA.hy926细胞线粒体膜通透性转换孔开放的机制[D];西北农林科技大学;2016年

2 黄鹤;大鼠肝脏再生时线粒体膜通透性转换及其调节的研究[D];第二军医大学;2005年

3 王佳;Calcein-AM检测凋亡过程中线粒体膜通透性变化研究[D];华中科技大学;2006年

，

本文编号：735605