甲基叔丁基醚细胞毒性作用的蛋白质组学研究

发布时间：2017-08-25 12:07

  本文关键词：甲基叔丁基醚细胞毒性作用的蛋白质组学研究

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【摘要】：甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)作为一类广泛应用于汽油添加剂的有机小分子,近年来的职业暴露和环境暴露日益增多。研究表明甲基叔丁基醚在细胞水平及整体动物水平对生物体产生毒性作用,其潜在的毒性和生物学效应包括急性毒性、生殖毒性、遗传毒性、致癌性、细胞凋亡及氧化应激等,但其毒性作用机制不明。本研究结合毒理学研究方法和蛋白质组学技术,探讨MTBE诱导中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞的氧化应激效应和蛋白质组的改变,在分子水平探讨MTBE的潜在毒性作用。本论文主要开展了以下两部分的研究工作:1.MTBE对CHO细胞的体外毒性作用及氧化应激效应培养CHO细胞,使用不同浓度(0~100 mmol/L)的MTBE处理CHO细胞6h、12h、24h,MTT法观察细胞的增殖抑制作用,确定MTBE作用CHO细胞剂量-效应关系。设置空白对照组,以0.5 mmol/L、5.0 mmol/L、25.0 mmol/L、50.0 mmol/L和100 mmol/L为处理组,处理时间均为12 h,用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)生成量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力等氧化应激相关各项指标,同时运用荧光定量PCR和Western blot技术检测氧化应激相关基因和蛋白表达水平。研究发现:处理后的CHO细胞,其存活率下降,并呈剂量-效应关系;同时LDH漏出,MDA含量都随MTBE剂量的增大而升高,且呈现剂量-效应关系,但ROS生成量却随MTBE剂量的增大而降低,SOD、CAT及GSH酶活力都呈升高趋势。此外,随着MTBE浓度的升高,SOD1、CAT、GPX-1的基因和蛋白表达水平与对照组相比都有不同程度的升高。这一结果也与前期的相关酶活力的变化趋势呈现很好的一致性。因此,MTBE暴露可以抑制CHO细胞增殖并引起氧化应激效应,提示氧化应激效应可能参与MTBE致CHO细胞的毒性作用。2.MTBE致CHO细胞毒性作用的蛋白质组学研究参考确定的剂量-效应关系,MTBE暴露以0 mmol/L、5.0 mmol/L和100.0mmol/L 3个剂量对CHO细胞进行12 h处理,制备蛋白样品进行荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE),对差异表达蛋白进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定并进行生物信息学分析,再使用Western blot对差异蛋白进行进一步的验证。研究发现:通过2D-DIGE和MALDI-TOF-MS/MS质谱技术,测定了在MTBE处理下CHO细胞蛋白质组的差异表达,共鉴定出24个蛋白,与对照组相比,有16个蛋白的表达上调,8个蛋白的表达下调。对这些差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出4个与细胞毒性以及氧化应激相关的蛋白分子,分别为:Stress-70 protein,mitochondrial(GRP75)、Heat shock cognate 71 kDa protein(HSC70)、40S ribosomal protein SA(RPSA)和Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase(PPIA),通过Westernblot进行蛋白验证,其表达变化情况与CHO细胞蛋白质组学的实验结果相符合。因此,MTBE暴露可以诱导CHO细胞蛋白表达水平的变化,这些氧化应激相关蛋白表达水平的改变可能是MTBE致CHO细胞毒性作用的重要组成部分。
【关键词】：甲基叔丁基醚 CHO细胞 氧化应激 蛋白质组学
【学位授予单位】：湘潭大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-21
• 1.1 MTBE的物理化学性质11-12
• 1.2 MTBE的毒理学研究12-14
• 1.2.1 MTBE的急性毒性12
• 1.2.2 MTBE的遗传毒性12-13
• 1.2.3 MTBE的致癌性13
• 1.2.4 MTBE的生殖毒性13-14
• 1.3 蛋白质组学技术在毒理学中的应用14-17
• 1.3.1 蛋白质组学技术概述14-16
• 1.3.2 蛋白质组学技术在毒理学研究中的应用16-17
• 1.4 课题研究基础17-18
• 1.4.1 MTBE在不同细胞系中的毒性研究情况17
• 1.4.2 本课题组在蛋白质组学技术应用研究基础17-18
• 1.5 课题研究目的及实验方案18-21
• 1.5.1 课题研究目的及意义18
• 1.5.2 研究内容18-19
• 1.5.3 实验设计方案及技术路线19-21
• 第二章 MTBE诱导CHO细胞毒性作用和氧化应激效应21-44
• 2.1 前言21
• 2.2 实验材料21-24
• 2.2.1 主要仪器21-22
• 2.2.2 主要试剂22-23
• 2.2.3 细胞及受试物23
• 2.2.4 培养基及常用溶液配置23-24
• 2.3 实验方法24-33
• 2.3.1 细胞培养及处理24
• 2.3.2 细胞增殖试验24
• 2.3.3 LDH漏出率检测24-25
• 2.3.4 细胞内活性氧的检测25-26
• 2.3.5 丙二醛含量的检测26
• 2.3.6 氧化应激相关酶活力的检测26-28
• 2.3.7 特定基因的mRNA表达检测28-31
• 2.3.8 相关蛋白表达检测31-33
• 2.4 结果33-41
• 2.4.1 细胞增殖抑制作用33-34
• 2.4.2 细胞形态变化34-35
• 2.4.3 LDH漏出率检测35
• 2.4.4 细胞内活性氧的检测35-36
• 2.4.5 丙二醛（MDA）含量的检测36
• 2.4.6 氧化应激相关酶活力的检测36-38
• 2.4.7 荧光定量PCR38-40
• 2.4.8 MTBE对蛋白表达的影响40-41
• 2.5 讨论41-43
• 2.6 本章小结43-44
• 第3章 MTBE对CHO细胞蛋白质组的影响44-69
• 3.1 前言44
• 3.2 实验材料44-46
• 3.2.1 主要仪器44-45
• 3.2.2 主要试剂45-46
• 3.2.3 细胞及受试物46
• 3.2.4 培养基及常用溶液配置46
• 3.3 实验方法46-52
• 3.3.1 CHO细胞染毒处理46
• 3.3.2 蛋白提取及处理46-47
• 3.3.3 蛋白定量47
• 3.3.4 荧光标记47-49
• 3.3.5 第一向等点聚焦49-50
• 3.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）50-51
• 3.3.7 二维凝胶荧光图像分析51
• 3.3.8 后染色（post-stained）的制备凝胶电泳51
• 3.3.9 挖点及蛋白酶解51-52
• 3.3.10 质谱鉴定及数据库搜索52
• 3.3.11 差异表达蛋白的Western blot验证52
• 3.4 结果52-66
• 3.4.1 蛋白定量结果52-53
• 3.4.2 2D-DIGE分析53-55
• 3.4.3 差异表达蛋白的质谱鉴定55-63
• 3.4.4 差异蛋白的功能分析63-64
• 3.4.5 差异蛋白的Western blot验证64-66
• 3.5 讨论66-67
• 3.6 本章小结67-69
• 第四章 结论与展望69-71
• 4.1 结论69
• 4.2 展望69-71
• 参考文献71-77
• 致谢77-78
• 附录 英文缩略词表78-79
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文79

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本文编号：736740