辐射敏感基因作为潜在生物剂量计的实验研究

发布时间：2017-12-08 21:31

  本文关键词：辐射敏感基因作为潜在生物剂量计的实验研究

  更多相关文章： 电离辐射 辐射敏感基因 实时荧光定量PCR 时间效应 剂量效应 生物标志物 生物剂量计

【摘要】：电离辐射能够导致DNA断裂引起基因表达发生变化,推测电离辐射敏感基因可能发展成为辐射损伤生物标志物,用于生物剂量的估算。现有的生物剂量计存在耗时耗力的问题,不能满足大批量受照人群的快速检测,因此需要建立一种快速、高通量的生物剂量估算方法应对大批量受照人群的剂量估算。本文将在前期基因芯片研究的基础上,对筛选出的辐射后差异表达、具有一定的剂量依赖性、本底值相对均一的TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、SPIB 5个辐射诱导上调基因和TCL1A 1个辐射诱导下调基因,利用实时荧光定量PCR进行深入研究,探索这些基因作为新型分子辐射生物剂量计的可行性。目的:研究辐射敏感基因照射后的时间效应和剂量效应关系以及健康人的本底水平,探讨其作为辐射损伤早期生物标志物应用于生物剂量估算的可行性。方法:1通过对TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A、SPIB 6个辐射敏感基因和β-actin 1个内参基因的引物特异性检测、探针非特异性排除、反应温度的优化、质粒标准品的构建和标准曲线的建立,建立实时荧光定量PCR检测方法。2采用不同剂量(0Gy、0.5Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy)的60Coγ射线照射正常人外周血,在照射后培养不同时间(0h、2h、4h、8h、12h、24h)收集,提取全血总RNA,采用实时荧光定量PCR的Taq Man探针两步法检测照射后TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A、SPIB 6个辐射敏感基因的m RNA表达水平,观察其随受照剂量和培养时间的表达变化,筛选具有辐射损伤生物标志物潜力的基因。3采集29名健康志愿者的外周血进行TRIAP1、RPS27L、AEN 3个基因本底水平的分析(男性15名,女性14名;年龄组分别为21-30岁组10人,31-40岁组10人,41-50岁组9人),提取全血总RNA,采用实时荧光定量PCR的Taq Man探针两步法检测辐射敏感基因m RNA的本底表达水平。4采用6-8周龄体重18-22g的雄性C57BL/6小鼠,进行不同剂量(2Gy、8Gy)的γ射线整体照射,未照射样0Gy为对照组;照射后不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h)采集血样提取总RNA,利用实时荧光定量PCR的Taq Man探针两步法检测照射后TRIAP1、RPS27L、AEN 3个辐射敏感基因和18S RNA 1个内参基因m RNA随剂量和时间的表达变化,研究辐射敏感基因在小鼠的整体照射后的表达效应。结果:1通过对6个辐射敏感基因和β-actin内参基因引物特异性的检测、探针非特异性排除、反应温度的优化、质粒标准品的构建和标准曲线的建立,建立了实时荧光定量PCR的检测方法。2在对外周血进行不同剂量照射培养不同时间后,与对照组相比,TRIAP1基因在2h、4h开始增加,8h达到峰值10.44,12h、24h略有下降,在8h、12h和24h呈现出较好的剂量依赖关系;RPS27L在2h各剂量下无明显增加,4h开始逐渐增加,8h达到峰值9.97,12h和24h下降至与4h相近的水平,在4h、8h、12h和24h呈现出较好的剂量依赖关系;AEN基因在2h开始增加,4h、8h和12h持续增加并呈现出一定的剂量饱和效应,24h开始下降但仍高于本底;C12orf5基因在2h各剂量点下均无显著增加,4h开始增加明显,8h、12h和24h表达变化水平相近呈现出一定的剂量依赖性;TCL1A基因在2h各剂量点下均无显著减少,在4h、8h、12h和24h略有减少但未呈现出明显剂量依赖关系;SPIB基因在4h、8h表达水平升高但无显著性差异,在2h、12h和24h在各剂量点下几乎没有响应。3不同剂量照射后,TRIAP1基因在8h、12h和24h拟合0.5-10Gy的剂量效应曲线分别为y=2.663ln(x)+4.3668,R2=0.9969;y=1.6162ln(x)+3.6017,R2=0.9799;y=1.0839ln(x)+2.9733,R2=0.9562;RPS27L基因在4h,8h,12h和24h 0.5-10Gy的剂量效应拟合曲线分别为y=0.7608ln(x)+2.141,R2=0.9594;y=2.1686ln(x)+4.3925,R2=0.9636;y=0.8334ln(x)+2.4676,R2=0.9684;y=0.4786ln(x)+2.023,R2=0.9204;AEN基因在2h,4h,8h进行0.5-6Gy剂量范围的剂量效应拟合曲线分别为y=1.31ln(x)+2.1332,R2=0.9326;y=2.3864ln(x)+5.2762,R2=0.9913;y=4.6111ln(x)+8.4048,R2=0.9829,在12h和24h进行0.5Gy-4Gy剂量范围的剂量效应拟合曲线分别为y=2.5651ln(x)+5.3049,R2=0.9715;y=1.8254ln(x)+4.7758,R2=0.9686。所有曲线方程的R2均大于0.92,说明剂量效应关系显著。4通过29个健康人本底水平检测后的结果得出,TRIAP1基因本底值是0.170±0.031,波动范围0.101-0.248,变异系数18.086%;RPS27L基因的平均值为1.450±0.183,波动范围是1.085-1.775,变异系数是12.641%;AEN基因的平均值为0.056±0.010,波动范围是0.041-0.075,变异系数是18.001%。3个基因的变异系数均在20%以内,波动范围小且相对均一。分别对TRIAP1、RPS27L和AEN基因进行年龄和性别因素的差异性分析,结果显示TRIAP1、RPS27L和AEN均不受年龄因素(P分别为0.732、0.284、0.153)和性别因素(P分别为0.445、0.469、0.278)影响。5 2Gy和8Gy照射小鼠并在照射后饲养不同时间,与对照组相比,TRIAP1基因在照射后0-48h随时间的延长表达水平不断上升,在24h、48h和72h表达水平具有显著性差异(P0.05),在48h达到峰值15.18,72h略有下降;RPS27L基因在4h和8h表达变化水平较高仅在8Gy剂量下4h与对照比无显著性差异,12h迅速下降,24-72h逐渐恢复至接近本底水平;AEN基因在4h开始逐渐升高,24h达到峰值4.10,随后逐渐下降,在8-72h表现出一定的差异性(P0.05)。TRIAP1、RPS27L和AEN基因在0Gy、2Gy和8Gy照射下无显著剂量依赖关系。结论:1建立了Taq Man探针两步法的实时荧光定量PCR的检测方法。2γ射线不同剂量照射人外周血后培养不同时间,TRIAP1、RPS27L和AEN在不同的时间点表达水平显著升高并且具有较好的剂量依赖关系,提示这3个辐射敏感基因具有作为辐射损伤生物标志物的潜力,适用于辐射损伤早期生物剂量的估算。TCL1A、SPIB基因时间效应和剂量效应关系不显著,C12orf5基因相对表达变化水平低,这3个基因不具有作为辐射敏感基因的潜力。3通过本底水平的检测,TRIAP1、RPS27L和AEN基因本底波动范围小、本底水平均一且不受年龄和性别因素的影响,满足作为生物标志物的要求。4通过小鼠整体照射的研究发现,TRIAP1、RPS27L和AEN基因在小鼠体内均有响应。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R818

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