交感神经调控血小板生成及其对辐照小鼠血小板减少的促恢复作用

发布时间：2018-01-20 05:05

本文关键词： 巨核细胞迁移血小板前体交感神经兴奋血小板生成　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来,随着核能在军事、医疗、能源、食品加工、育种等邻域的广泛应用,机体受到射线照射而引发的各种放射性损伤也在逐渐增加。已知骨髓对电离辐射非常敏感,因此,骨髓受到射线照射后,极易引起放射性损伤。研究发现,当机体受到电离辐射后,会引起骨髓多系造血功能障碍,其中由巨核系造血功能障碍引起的血小板水平数量减少可以导致机体出现以出血、感染、代谢紊乱为代表的多种症状,甚至可出现死亡。因此,深入认识血小板生成的调控机制,并寻找有效促进辐射损伤后血小板水平恢复的手段,是辐射损伤救治的关键环节。研究表明,机体受照后,射线可直接作用于生物大分子,造成DNA链断裂,蛋白失活,或者细胞膜结构或通透性改变,造成细胞损伤;电离辐射还可通过作用于水分子产生辐射分解产物,后者会再次作用于生物大分子,从而加重细胞损伤。此外,我室早期研究辐射损伤时,程天民院士等曾观察到一种“巨核细胞被噬”(megakaryocytophagia)的现象,该现象提示骨髓巨核细胞又可以被中性粒细胞吞噬。因此,机体受到放射损伤后骨髓巨核细胞(megakaryocyte,MK)和外周血血小板数量降低尤为显著。针对该现状,人们不断寻找能够促进血小板生成的药物,结果发现以血小板生成素(thrombopoietin,TPO)为代表的促血小板生成因子可通过作用于巨核细胞生成的多个阶段,诱导造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)增殖、分化形成成熟MKs并释放出血小板,从而有效促进放射损伤后血小板水平恢复。遗憾的是,TPO体内应用并不能缩短血小板处于低谷期的时间,并可诱导机体产生中和性抗体,从而使其应用受到一定限制;而IL-11又是FDA批准使用的唯一促血小板生成药物。因此,寻找新的、更多的促进放射损伤后血小板水平恢复的手段显得尤为必要。在研究电离辐射引起血小板数量减少的过程中,人们发现各种内外界因素作用于机体后,会引起机体内包括交感—肾上腺髓质(sympathetic-adrenal medulla system,SAS)轴在内的多个内环境稳态轴做出综合性适应反应,其中SAS轴释放的去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)和肾上腺素(epinephrine,EPI)等儿茶酚胺类物质可通过与不种组织和细胞上相应的受体结合,从而而发挥不同的调节作用。研究表明,骨髓有丰富的交感神经支配,交感神经兴奋后,sas轴释放的ne和epi在造血调控中发挥着重要作用。前期研究结果证实,ne和epi不仅能够促进cd34+细胞增殖,调控造血干/祖细胞的迁移;ne和epi还可通过对hscs的子代细胞产生一系列影响,如sas释放的ne或epi可通过与不同的肾上腺素受体结合,从而调控淋巴细胞生成和红细胞生成,并参与血小板活化等过程。但是,交感神经支配是否参与了血小板生成的调控,目前还未见相关报道。因此,深入研究交感神经兴奋在血小板生成和活化过程中的作用,不仅有助于进一步解读交感神经的功能,揭示血小板生成的调控机制,而且可以为放射损伤后血小板水平恢复的救治提供新思路。长期以来,本室紧紧围绕放射损伤引起血小板数量减少的发生原因,致力于血小板生成调控机制研究和相关基因工程药物研发。在研究中,我们发现小鼠在应激状态下外周血血小板处于高水平。因此,我们首先通过复制噪音和超负荷运动应激模型,观察连续应激刺激后小鼠外周血血小板水平变化,分析连续应激刺激是否能够促进血小板生成。在此基础上,采用肾上腺素受体阻断,β羟基转移酶缺陷(dbh-/-)小鼠以及血小板生成素tpo受体缺陷(c57bl/6j-mplhlb219/j)小鼠等手段,证实交感神经兴奋是促进体内血小板生成的重要因素;体外采用多种分析方法,检测ne和epi对cd34+细胞增殖和分化、巨核细胞定向分化、增殖、粘附和迁移、血小板前体形成、以及血小板释放和活化等多个血小板生成阶段的影响,分析交感神经兴奋促进血小板生成和活化的具体机制;最后,复制放射损伤小鼠模型,探讨交感神经兴奋对放射损伤小鼠的血小板水平促恢复作用。通过上述研究,取得的结果与结论如下:1、复制了噪音和超负荷运动应激模型,发现c57bl/6小鼠受到连续应激刺激后血小板水平逐渐升高,提示连续应激刺激能够升高机体外周血血小板水平;进一步通过综合分析脾脏切除小鼠、多巴胺β-羟化酶缺陷(dopamineβ-hydrolylasedeficient,dbh-/-)小鼠以及c57bl/6j-mplhlb219/j小鼠连续应激后血小板数量变化,证实交感神经兴奋具有促进血小板生成的作用。2、在巨核细胞生成早期阶段,流式检测结果表明,ne和epi虽然具有促进cd34+细胞增殖的作用,但不能促进cd34+细胞向巨核细胞分化,也不能促进巨核细胞增殖。3、荧光酶标仪和transwell检测结果提示,ne和epi能够以剂量依赖方式促进巨核细胞粘附和迁移;α受体阻断后,ne和epi诱导粘附和迁移的细胞数目显著减少,表明ne和epi通过α受体促进巨核细胞粘附和迁移;4、westernblot分析发现,ne和epi处理可增强erk1/2磷酸化蛋白的表达,但α及α2受体阻断后,erk1/2的磷酸化蛋白表达显著减弱,提示ne和epi具有通过α2受体激活ERK1/2通路的能力;进一步阻断α2受体和ERK1/2信号通路后,发现NE和EPI诱导粘附和迁移的巨核细胞数目显著减少,证实NE和EPI能够促进巨核细胞粘附和迁移。5、激光共聚焦结果显示,NE和EPI能够以剂量依赖方式促进晚期巨核细胞形成血小板前体,提示NE和EPI具有促进巨核细胞终末分化的作用。6、NE和EPI能够上调晚期巨核细胞RhoA磷酸化蛋白的表达;RhoA GTP酶活性抑制后,NE和EPI诱导血小板前体形成的伪足延长,形成典型的“串珠样”结构,提示NE和EPI的促血小板前体形成作用与RhoA GTP酶的活性相关。7、α2受体和ERK1/2通路阻断可抑制NE和EPI诱导的RhoA磷酸化蛋白表达,并导致血小板前体的形成数目显著减少,提示NE和EPI通过α2受体,激活ERK1/2-RhoA通路,是NE和EPI促进血小板前体形成的具体机制。8、流式细胞仪检测发现,NE和EPI能够促进晚期巨核细胞生成血小板,进一步证实NE和EPI主要作用于巨核细胞终末分化阶段而促进血小板生成。9、Western Blot和流式细胞仪结果综合提示,NE和EPI与α2受体结合,激活ERK1/2通路,可能是NE和EPI促进血小板活化的具体机制。10、体内研究结果提示,NE和EPI腹腔注射具有促进巨核细胞向血管龛迁移,从而升高C57BL/6小鼠外周血血小板水平的作用,表明NE和EPI体内能够促进血小板生成。11、成功复制重度放射损伤小鼠血小板减少症动物模型(6.0 Gyγ射线全身一次性照射)。外周血血小板数量动态监测结果显示,NE和EPI体内应用可显著升高受照小鼠外周血血小板水平;表明交感神经兴奋具有促进放射损伤小鼠血小板水平恢复的作用。12、复制了重度急性辐射损伤后骨髓移植动物模型(10.0 Gyγ射线照射后接受骨髓移植),在在血小板水平处于最低值时给予交感神经刺激可以显著加快血小板水平恢复速度,减轻出血倾向,进一步证实交感神经刺激具有促进放射损伤小鼠血小板水平恢复的作用。总之,通过本实验我们首先发现了交感神经兴奋具有促进血小板生成的作用,并初步探讨了该作用对放射损伤所致血小板减少症的救治意义。该研究进一步丰富了人们对交感神经功能的认识,填补了交感神经在血小板生成调控研究领域的空白,同时也为临床放射损伤的救治提供了新的线索。
[Abstract]:In recent years , as nuclear energy has been widely used in military , medical , energy , food processing , breeding , etc . , various radioactive damage caused by radiation exposure has been increasing . Bone marrow is known to be very sensitive to ionizing radiation . In this study , it is necessary to study the effect of sympathetic nerve stimulation on the platelet count . In this study , it is shown that NE and epi can not only promote cd34 + cell proliferation and regulate the migration of hematopoietic stem / progenitor cells . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . It is suggested that NE and epi can promote the adhesion and migration of eukaryotic cells . The results suggest that NE and EPI can promote the formation of thrombocyte precursors by NE and EPI . It is suggested that NE and EPI can promote the formation of platelet precursors . The results of dynamic monitoring of platelet count in peripheral blood indicate that the application of NE and EPI can significantly increase the blood platelet level of irradiated mice . It is shown that sympathetic nerve stimulation has the effect of promoting the recovery of platelets in irradiated mice . In conclusion , we have found that sympathetic nerve stimulation has the effect of promoting the recovery of platelets in radiation injury mice . In conclusion , we have found that sympathetic nerve stimulation has the effect of promoting the recovery of platelet in radiation injury mice .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R818

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