二维及三维培养条件下电离辐射诱导成纤维细胞适应性反应及其机制研究

发布时间：2018-01-22 20:40

本文关键词： 二维培养三维培养成纤维细胞电离辐射适应性反应　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：低剂量电离辐射诱导适应性反应(Adaptive response，AR)是指预先给予的小剂量的电离辐射能使机体对其后的大剂量电离辐射产生一定的耐受，减轻大剂量辐射引起的损伤或后果。相关的机制主要涉及免疫调控、活性氧物质(Reactiveoxygen species，ROS)、DNA损伤修复、细胞信号转导以及与p53蛋白有关的细胞周期阻滞等方面。由成纤维细胞等构成的肿瘤微环境在肿瘤的发生及发展中发挥着重要的作用。相关的研究表明，低剂量电离辐射诱导成纤维细胞的某些生物效应在肿瘤的增殖及转移等方面发挥着不可忽视的作用。其有关的机制尚不十分明确，有待于进一步研究。三维培养（3-D）是一种模拟体内微环境的一种细胞培养模式。与单层（二维、2-D）细胞培养比较，其特点主要体现在细胞出现极化、形成粘附复合物以及出现细胞骨架和细胞容量的等特征性表现，并导致细胞表型、功能和信号调节发生改变，使其更接近体内的生理性和病理性表征。3-D培养为模拟体内的生理性和病理性环境、研究分子机制、体外培养和制作移植用组织提供独特的技术支持和保障。电离辐射诱导DNA双链断裂（DNAs），可以作为电离辐射生物效应的监测手段。磷酸化的H2AX基因(γ-H2AX)参与DNA损伤修复并聚集在DNA双链断裂点，常被用来作为DNA双链断裂监控的指标。目的：探讨多种成纤维细胞株在2-D及3-D培养条件下不同剂量和剂量率电离辐射诱导适应性反应及相关机制。方法： 1、本实验在2-D及3-D培养条件下培养三种成纤维细胞株（RMP-4、IMR-90及MEF）。 2、RMP-4细胞在2-D培养条件下，不同辐射剂量和不同时间点观察γ-H2AX焦点和荧光强度，确定最佳辐射剂量和检测时间。 3、辐射剂量范围以0~100mGy作为低剂量（高剂量率，D1)诱导适应性反应，以1~5Gy作为攻击剂量(D2)诱导DNA双链断裂，时间间隔6h。 4、通过免疫荧光分析法检测三种成纤维细胞（RMP-4、IMR-90及MEF）核内γ-H2AX焦点，评估电离辐射诱导DNA双链断裂及低剂量电离辐射所诱导的适应性反应。 5、通过Western blot检测各处理组细胞相关基因蛋白（p53、p21、p53（ser15））表达，验证相关的机制。 6、在2-D及3-D培养条件下，同一剂量不同剂量率照射RMP-4细胞，通过免疫荧光检测γ-H2AX焦点，评估不同剂量率电离辐射诱导DNA双链断裂程度。 7、在2-D及3-D培养条件下，不同剂量电离辐射照射RMP-4细胞后，经pholloidin染色处理，通过荧光显微镜和共聚焦显微镜观察细胞形态学变化。 8、ImageJ软件对蛋白电泳条带做灰度分析。 9、统计结果以均数±标准差（x±s）的形式表达，Student t test或方差分析的方法对所得数据进行统计分析。P0.05被认为具有统计学意义，所有的数据应用SPSS12.0软件，Origin6.0软件绘图。结果： 1、电离辐射诱导成纤维细胞株RMP-4的DNA损伤时程/量效分析： RMP-4细胞在2-D培养条件下，给予2Gy X射线电离辐射照射，然后分别继续培养0.5、1、2、4h，通过免疫荧光分析法观察γ-H2AX焦点和荧光强度。结果显示：细胞在照射后0.5h，细胞内γ-H2AX焦点数量明显增多，至1h其数量达到高峰，持续到4h仍然处于明显增多状态，阳性细胞数量从对照组的15%增加到1h的87%，中间的0.5、2、和4h分别为45%、85%和81%，且差异均有明显的统计学意义（P0.05）。将相同培养条件下的RMP-4细胞分别给予0、0.1、0.5、1、2和5Gy(0.8676Gy/min)的X射线照射，1h后通过免疫荧光染色法观察γ-H2AX焦点和荧光强度。结果显示：0.1Gy的低剂量即可诱导成纤维细胞γ-H2AX聚集焦点增加，阳性细胞数量从0Gy组的21%增加到5Gy组的近100%，差异均有统计学意义（P0.05）。上述实验表明：电离辐射诱导成纤维细胞株RMP-4的DNA双链断裂在一定照射剂量及时间范围内具有剂量和时间依赖性。 2、低剂量电离辐射诱导成纤维细胞株RMP-4的适应性反应及机制 RMP-4细胞在2-D培养条件下，预先给予50mGy或100mGy的低剂量X线照射，6h后再给予2Gy攻击剂量，通过免疫荧光法检测细胞内γ-H2AX焦点和荧光强度。结果发现，γ-H2AX阳性细胞由2Gy照射组的87%，分别降低到65%和45%（P0.05）。说明预先给予的低剂量照射可以明显增加RMP-4细胞对随后给予的2Gy攻击剂量电离辐射的耐受。将RMP-4细胞预先给予D1低剂量预照射，6h后联合D2（2Gy）攻击剂量照射，然后通过Western blot检测相关蛋白表达情况。经条带灰度分析表明：直接D2的剂量照射组p53、p21和γ-H2AX明显升高（P0.05），而预先给予25、50、75和100mGy的D1剂量后再给予2Gy的D2剂量组，与直接给予D2剂量组比较，p21和γ-H2AX蛋白表达水平明显降低（P0.05），尤其75mGy+D2组降低最为明显。但p53蛋白的变化在D1+D2的各处理组变化均不明显。因此在后续实验中将检测磷酸化p53（ser15）蛋白表达情况。 3、低剂量电离辐射诱导成纤维细胞株IMR-90适应性反应及机制成纤维细胞株IMR-90在2-D培养条件下给予D2（2Gy）或者低剂量的D1+D2（6h）的X射线照射，通过细胞免疫荧光法检测γ-H2AX和p53（ser15）表达和聚集情况，通过计算细胞焦点数和阳性细胞数量，并统计分析不同处理组差异。结果显示：IMR-90细胞给予D2攻击剂量后，细胞内γ-H2AX焦点数量由平均基础数量的10个/细胞，增加到40个/细胞（P0.05）。但将IMR-90细胞预先给予D1（分别为25、50、75和100mGy）诱导剂量后，6h后再次给予D2攻击剂量照射。细胞γ-H2AX焦点平均数量明显低于单独D2剂量组（P0.05）。其中75mGy+D2组焦点数量相对最低，约24个/细胞。100mGy+D2组焦点平均30个/细胞，但仍然明显低于单独D2攻击剂量组。按照阳性细胞数法统计各处理组结果发现：假照组、D2组、25mGy+D2、50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2组，γ-H2AX阳性细胞比例分别为20%，98%，97%，60%，50%和80%。各D1+D2组与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。通过Western blot检测γ-H2AX蛋白表达并对蛋白条带进行灰度值分析，计算相对蛋白表达水平。结果显示：各组蛋白条带灰度值分别为0、2.9、0.90、0.85、0.70和0.25。各D1+D2组与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。以上结果说明：低剂量电离辐射能够诱导成纤维细胞株IMR-90对随后攻击剂量D2的照射而产生耐受，即适应性反应。通过细胞免疫荧光分析p53（ser15）阳性细胞数，各组值分别为4%、40%、39%、29%、20%和30%。其中50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2组与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。分析Western blot各组条带灰度值，各组p53（ser15）灰度值为2.0、2.75、2.25、2.25、2.50和2.65。结果表明：25mGy+D2、50mGy+D2、75mGy+D2与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。各组p21蛋白条带相对灰度值分别为1.80、2.85、2.10、1.65、1.75和1.25。其中50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2组与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。 4、低剂量电离辐射诱导成纤维细胞株MEF适应性反应及机制成纤维细胞株MEF在2-D培养条件下给予D2（2Gy）或者低剂量的D1+D2（6h）X射线照射，通过细胞免疫荧光法检测γ-H2AX表达和焦点聚集情况，通过计算细胞焦点数和阳性细胞数量，并统计分析不同处理组差异。结果显示：MEF细胞给予D2攻击剂量后，细胞γ-H2AX焦点数量由平均基础数量的8个/细胞，增加到了35个/细胞（P0.05）。但MEF细胞预先给予D1（分别为25、50、75和100mGy）诱导剂量后，6h后再次给予D2电离辐射照射。细胞γ-H2AX焦点平均数量明显低于单独D2组（P0.05）。其中75mGy+D2组焦点数量相对最低，约16个/细胞。25mGy+D2和100mGy+D2组焦点平均20个/细胞。按照阳性细胞数方法统计各处理组结果显示：假照组、D2组、25mGy+D2、50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2组，γ-H2AX阳性细胞比例分别为17.5%，84%，69%，49%，45%和70%，各D1+D2组与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。其中75mGy+D2组γ-H2AX阳性细胞比例为各处理组中阳性细胞比例最低组。通过Western blot检测γ-H2AX蛋白表达，并对蛋白条带进行灰度分析，计算相对表达水平。结果表明：各组蛋白条带灰度值分别为0、1.75、0.50、0.32、0.35、和0.45，各D1+D2组与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。通过细胞免疫荧光法分析p53（ser15）阳性细胞数，各组值分别为0、20%、15%、15%、5%和5%。分析Western blot条带灰度值，各组p53（ser15）相对值分别为0.29、0.65、0.45、0.40、0.40和0.40。各组p21蛋白条带相对灰度值分别为0.49、0.78、0.60、0.50、0.40和0.40。p53和p21基因条带分析结果表明：各D1+D2组与单独D2组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。以上结果说明，低剂量电离辐射能够诱导成纤维细胞株对随后攻击剂量的D2电离辐射照射而产生耐受，即适应性反应，且p53和p21基因与低剂量电离辐射诱导的适应性反应有明显的相关性。 5、2-D与3-D培养条件下电离辐射诱导适应性反应的比较成纤维细胞株RMP-4分别在2-D和3-D培养条件下，并给予0.5Gy X射线照射，剂量率分别为低（LDR）0.0184Gy/min、中(MDR)0.2Gy/min和高(HDR)0.8676Gy/min剂量率，结果发现两种条件下培养的RMP-4细胞经电离辐射照射后，随着剂量率的增加，γ-H2AX焦点阳性细胞的数量随之增多。2-D组γ-H2AX阳性细胞比例分别为4.9%、5.2%、11%和46%（P0.05）；3-D组γ-H2AX阳性细胞比例分别为6%、9%、17%和72%（P0.05）。提示相同照射剂量下不同剂量率对2-D和3-D培养条件下的DNA双链断裂损伤的结局均存在明显差异，且3-D培养条件下差异更加明显（P0.05）。说明3-D培养条件下，DNA的损伤程度对剂量率增加表现更为敏感。为了进一步比较2-D和3-D培养条件下电离辐射诱导的适应性反应的差异，通过荧光显微镜和共聚焦显微镜观察细胞形态变化。结果显示：在2-D培养条件下，表现为细胞生长浓密、伸展并且相互交联在一起，经X射线照射后细胞胞体卷曲。3-D培养条件下，表现为细胞个体清晰、舒展，且胞体饱满。当细胞给予0.1、0.5或2Gy电离辐射照射后，，细胞形态发生明显改变，一部分细胞出现了明显的异常形态，表现为伪足消失、细胞卷曲等。另有一部分细胞处于正常和异常形态之间，我们定义为中间态，从结果可见，3-D培养条件下细胞形态对电离辐射的反应更加生动、具体及形象。 2-D培养条件下，RMP-4细胞给予2Gy或者75mGy+2Gy照射，显微镜下观察RMP-4细胞形态并统计。结果表明：2-D培养条件下，细胞生长致密而伸展，相互交织，2Gy X射线照射后细胞则皱缩卷曲，但纹理仍清晰，经75mGy+2Gy照射后，细胞没有明显的形态学变化；3-D培养条件下，细胞给予2Gy或者75mGy+2Gy照射，显微镜下观察细胞形态变化并统计。结果表明：电离辐射后，3-D培养条件下的异常形态细胞数目明显增多，由基础比例的28%增加到2Gy照射组的80%（P0.05），中间态的细胞略有增加（约占5%）。75mGy+2Gy组异常细胞比例为34%明显低于2Gy组异常细胞比例，但高于对照组（P0.05）。75mGy+2Gy组中间态的细胞增加至占20%，明显高于2Gy组（P0.05）。上述实验结果提示：3-D培养条件与2-D培养条件相比较更易观察到成纤维细胞的适应性反应，这可能与3-D培养条件更接近细胞体内生长的真实环境，相对更容易激活其他信号通路，从而激活细胞的适应性反应。结论 1、低剂量电离辐射可诱导2-D和3-D培养条件下成纤维细胞的适应性反应； 2、适应性反应在3-D培养条件下比2-D培养条件下更容易被诱导，可能存在潜在的致死性损伤修复机制； 3、p53和p21可能参与到低剂量电离辐射诱导的适应性反应，低剂量电离辐射诱导适应性反应的机制仍然需要进一步深入的研究； 4、3-D培养条件下更有利于从形态学上观察电离辐射诱导的适应性反应。综上所述，本研究课题建立细胞3-D培养模式用来模拟体内条件，采用免疫荧光法和Western blot检测和验证2-D培养条件下低剂量电离辐射所诱导的适应性反应及其可能机制；并对比观察在2-D和3-D培养条件下不同剂量和剂量率所诱导的适应性反应的差别及细胞形态的差异，为研究3-D培养条件下成纤维细胞的辐射特性及其对肿瘤细胞支持作用研究提供依据，为进一步研究肿瘤细胞微环境在电离辐射治疗肿瘤中的作用及机制研究奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R818

【参考文献】