致死性EV71感染的病理学及分子病毒学研究

发布时间：2018-01-22 22:16

  本文关键词： 手足口病 肠道病毒71型 病理学 逆转录-聚合酶链反应 中和抗体 鼠适株 杆状病毒表达系统 类病毒颗粒 基因工程疫苗　出处：《华中科技大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：手足口病（Hand,foot and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒感染引起的一种严重的传染病，并呈现逐年高发态势。近年发现HFMD主要病原体为肠道病毒71型（Enterovirus71, EV71），儿童为EV71易感人群。儿童感染EV71后临床表现形式多样，除典型的HFMD外，还常表现出严重的中枢神经疾病及肺水肿和/或肺淤血等并发症，严重的甚至导致死亡。目前对于EV71感染引发HFMD的发生发展过程尚不清楚，且缺乏有效的预防及治疗方法，常导致临床医疗严重后果的发生，因此明确HFMD病原，全面分析EV71感染后病理改变，探讨发病机理，以及研发安全、有效的HFMD疫苗成为预防和控制HFMD疾病暴发的有效手段之一。据此，本论文从一例疑似HFMD的死亡案例出发，从法医病理学、分子病毒学、动物实验等几个方面对该病例及其致病病原EV71进行了深入的研究，具体内容有以下五个章节。 第一章以文献综述的形式介绍了HFMD及EV71的研究背景，主要包括HFMD的流行情况，其主要病原体EV71的病毒学特点，流行病学研究，致病机理研究，EV71感染的临床诊断和治疗，疫苗的研究现状，实验动物的选择以及杆状病毒表达系统的原理、技术路线及其作为基因工程疫苗载体的研究进展等。最后说明了本论文研究的内容及意义。 第二章利用常规法医病理学分析方法，对一例疑似HFMD致死案例进行了分析，发现CNS病变明显，，神经细胞坏死、胶质小结形成、炎细胞呈袖套样浸润，肺水肿显著、炎症突出，确认死因为病毒性脑炎及病毒性肺炎导致的急性呼吸、循环功能衰竭。在此基础上利用RT-PCR技术，以国家CDC指导的EV71通用检测引物，证实病原体为EV71。随后针对EV71保守区设计特异性引物进行巢式PCR扩增，检测了各病理组织的病毒载量；利用抗EV71VP1蛋白的特异性多克隆抗体对石蜡切片进行免疫组织化学染色检测了病毒抗原的组织分布。结果显示此病例脑组织EV71病毒载量相对较高，其中脑干和颈髓最高；病毒抗原检测阳性主要集中在CNS的神经细胞及炎细胞，为病毒感染复制的主要部位；肺组织虽病变明显，水肿/淤血突出，但病毒核酸及抗原阴性，并非病毒主要感染复制部位； 第三章自病毒载量最高的脑干组织出发，在体外RD细胞上进行病毒的分离、传代及空斑纯化，通过一步法生长曲线的方法了解不同株纯化病毒的感染性差异，同时利用EV71-VP1基因的序列对病毒株进行基因分型。筛选出一株纯化病毒，扩增出核酸序列进行分段克隆，获得EV71病毒的全基因组，并提交GenBank。结果显示：脑干组织能成功分离到EV71-xf活病毒，在RD细胞上能产生肠道病毒特异性致细胞病变效应（Cytopathic effect, CPE），透射电镜能观察到大小均匀、形态一致、直径约20～30nm的EV71病毒粒子。经空斑纯化后的四株病毒在体外RD细胞上感染性基本无差别，VP1测序结果显示均为C4亚型；完成了一株病毒的全基因组测序，基因组全长为7405bp，GenBank登录号(Accession number)为JQ804832，基因组序列提示此次感染病毒仍为国内流行株C4亚型，全基因组序列的测定将有利于后续的深入研究。 第四章对纯化的EV71-xf病毒进行了建立小动物感染模型的初步摸索。通过颅腔注射（Intracranial injection, IC）的途径使1日龄Balb/c小鼠感染EV71-xf病毒，观察其表现，隔周采血对血清特异性抗体IgG及中和抗体进行检测，同时分离鼠脑组织中病毒再次接种1日龄小鼠，获得鼠适性毒株。结果发现1日龄Balb/c小鼠能通过IC途径感染EV71-xf，但无明显的神经系统受累表现；血清抗体IgG在感染两周后较高，但仍处于亚中和抗体水平；IC二次感染可以刺激小鼠产生更高浓度IgG，并在RD细胞上表现出较好的特异性及交叉性中和保护作用；母传抗体的中和保护作用较强，但时间短暂，约4w龄时其保护作用消失；反复多次鼠脑适应，可以得到感染性增强的鼠适株EV71-xf/A/J/Q，但其毒力情况还需进一步研究。 第五章利用杆状病毒表达系统开展了EV71基因工程疫苗的初步研究。将编码EV71-xf的P1和3CD蛋白的基因分别克隆至pFastBac-Dual载体的启动子pPh和pP10下游的多克隆位点，构建重组pFastBac Dual-EV71-xf-3CD-P1质粒。重组质粒与杆状病毒Bacmid转座后获得重组Bacmid Bac-EV71-xf-3CD-P1。提取重组Bacmid DNA转染昆虫Sf9细胞，获得重组病毒，重组病毒感染昆虫细胞后，表达的前体蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自组装为病毒样颗粒（Virus Like Particle, VLPs），经蔗糖及氯化铯密度梯度离心进行初步的纯化，Western Blot检测目的蛋白表达与剪切，透射电镜观察VLPs颗粒；另外还构建了新的稳定表达3CD的细胞系Sf9-3CD，用于VLPs的构建策略。结果显示，重组杆状病毒AcBac-EV71-xf-3CD-P1在Sf9细胞内能同时表达前体蛋白P1和蛋白水解酶3CD，3CD能正确剪切P1蛋白成为VP1等结构蛋白，并自组装为VLPs，经蔗糖及氯化铯密度梯度离心等初步纯化后，Western Blot显示VLPs具有VP1的抗原表位，透射电镜观察VLPs的形态、大小及构象均类似于天然的EV71病毒粒子，可以作为EV71疫苗的候选物。Sf9-3CD细胞系能稳定表达3CD蛋白并剪切P1，形成VLPs，可以作为构建VLPs的新途径。 综合以上研究内容，本研究完成了一例疑似HFMD案例的法医病理学分析，确定了其致病病原为肠道病毒EV71，并从病理组织中分离、纯化到一株高活性的EV71-xf病毒，完成了该病毒株的病毒感染活性检测、全基因组序列测定、小鼠感染性试验以及基因工程疫苗等初步研究。该研究为致死性EV71病毒感染的组织病变过程的解析和机理研究提供了重要的实验数据，也为EV71病毒的基因工程疫苗研究奠定了基础，对预防和控制HFMD的工作作出了重要贡献。
[Abstract]:Foot and mouth disease (Hand foot, and mouth disease, HFMD) is a serious infectious disease caused by enterovirus infection, and has been the trend of high incidence. HFMD were the major pathogens of enterovirus 71 (Enterovirus71, EV71) found that in recent years, children are susceptible population. EV71 children infected with EV71 clinical manifestation diversity, in addition to typical HFMD, they often show severe central nervous diseases and pulmonary edema and / or pulmonary congestion and other complications, serious and even lead to death. The occurrence and development of HFMD caused by EV71 infection is not clear, and the lack of effective prevention and treatment, clinical medical treatment often leads to serious consequences therefore, clear HFMD pathogens, a comprehensive analysis of the pathological changes after EV71 infection, pathogenesis, and the development of safe and effective HFMD vaccine to prevent and control HFMD outbreaks of effective means of. Accordingly, this paper Based on a case of suspected HFMD death, we studied the case and its causative agent EV71 from forensic pathology, molecular virology and animal experiments. The contents are divided into five chapters.
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本文编号：1455873