芥子气“脂库”蓄积的发现验证与亲脂型清除剂的筛选和评价

发布时间：2018-03-30 00:14

本文选题：芥子气　切入点：芥子亚砜　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文

【摘要】：芥子气(Sulfur Mustard,简称SM,美军代号HD),是一种强效的糜烂性化学毒剂(也称起疱剂),号称“毒剂之王”,暴露后可造成眼睛、皮肤、肺脏等多组织脏器及粘膜损伤,且病程长难治愈。由于芥子气具有制备工艺简单、战斗减员能力强,极难治愈等特点,在战争中被多次使用。就我国而言,芥子气依然存在巨大的恐怖威胁;芥子气是日本遗弃化学武器的主要构成部分,特别是在东北地区,遗弃化学武器问题时有出现,例如2003年在齐齐哈尔就发生了日军遗留芥子气伤人事件。近年来,随着国内外反恐形势日趋严峻,我国周边安全环境复杂,芥子气被用于恐怖袭击的可能性日益增加。芥子气作为广泛的烷基化毒剂,可引起体内多靶点多脏器的中毒损伤,其毒理作用机制复杂,常规的毒理学研究无法完全解释其体内的转化过程以及物料平衡问题,其毒理学机制迄今为止仍未完全阐明,且尚无特效抗毒剂问世,因此临床上仅能采取洗消和改善症状为主的综合治疗措施。而目前应用的医学干预措施,则简单的将芥子气中毒损伤视为烧伤进行治疗,存在早期易误诊、皮肤损伤诊断滞后、皮肤虽经清创洗消后仍易反复糜烂溃烂、器官损伤无早期诊断指标、无特效解毒药等重要局限性。本论文采用“化学转化”策略,打破了芥子气等具有高反应活性化合物准确定量分析难的瓶颈,同时结合同位素稀释的LC-MS/MS技术,对芥子气暴露后动物体内芥子气原型及其氧化产物的含量、组织分布及代谢行为特点进行研究,发现并验证了芥子气原型“脂库”蓄积的现象。基于芥子气原型及其氧化产物的分布特点,设计具有亲脂性的芥子气清除化合物,以芥子气及其氧化产物的含量变化和动力学参数作为评价指标,筛选出适合体内芥子气清除的化合物,为芥子气暴露的医学干预新措施的研究奠定了良好的基础。本文共分为四章。第一章为前言,简要介绍了近年来芥子气相关研究进展,主要阐述了近年来芥子气暴露后的毒理损伤机制研究方面的进展,针对芥子气暴露的治疗药物研究现状,目前芥子气原型及其氧化产物的检测手段,最后介绍了脂肪组织在芥子气蓄积方面可能发挥的作用。并提出本论文的研究意义、研究内容和创新点。第二章建立了不同生物基质中芥子气原型及其氧化产物的LC-MS/MS方法,完成了方法学验证,并对生物基质中芥子气及其氧化产物同时定量方法的前处理步骤进行了优化;采用通过方法验证的检测方法对芥子气皮肤染毒大鼠体内芥子气原型及其氧化产物的含量进行测定。目前芥子气原型的检测方法多采用经典的气相色谱法或同位素示踪法等,但由于其具有较高的反应活性,在样品前处理以及仪器检测过程中不断进行反应难以对生物样品中芥子气原型及其氧化产物进行准确定量,从而无法准确进行其在体内的代谢行为研究。本论文基于同位素稀释的LC-MS/MS技术,利用化学转化的方式,将芥子气衍生化为稳定的且兼具良好色谱和质谱行为的衍生化产物,对复杂生物基质中芥子气原型的含量进行定量检测,该方法前处理简单、样品通量大、回收率高、精密度和准确度良好,可有效溯源分析生物基质中的芥子气原型。本论文还通过对芥子气及其氧化产物同时定量分析的方法进行了优化,增加了固相萃取前处理步骤,降低了生物样品基质效应干扰,使得方法能够准确定量检测大鼠脏器组织中芥子砜的含量。通过建立芥子气大鼠皮肤染毒模型,对芥子气皮肤染毒后大鼠全血、脂肪及部分组织脏器中芥子气及其氧化产物含量进行检测,结果显示芥子气透皮进入体内后,大鼠全血中芥子气原型可5 min即可检出,0.5-1 h达峰,而后迅速降低,但血液中芥子亚砜及芥子砜的含量则在3 h达峰,明显滞后于芥子气,表明芥子气经透皮进入体内后,存在由芥子气逐步氧化代谢生成芥子亚砜及芥子砜的过程。通过对芥子气原型及其氧化产物在体内的组织分布研究结果表明,脂肪组织中芥子气原型含量远远高于其它脏器组织,其含量在1-3 h达到峰值,而后逐渐降低,其含量水平存在一定的量效和时效关系,出现了芥子气原型“脂库”蓄积的行为,并且大大延长了体内芥子气原型的检测时间窗;而脂肪中芥子亚砜及芥子砜的含量较低,远低于其它脏器组织中氧化产物的含量,表明脂肪组织为相对惰性环境,相对抑制了芥子气的强烷基化反应活性,减缓其氧化代谢速率。尽管脏器组织中芥子气原型含量很低,但肾脏中存在较高的芥子亚砜含量,肝脏及脾脏中存在较高含量的芥子砜,并随时间延长,肝脏及脾脏中芥子气原型和芥子亚砜含量处于逐渐降低的过程,而芥子砜含量却呈现逐渐上升趋势,直至染毒后6 h达到峰值,提示芥子气的氧化代谢的过程可能发生在肝脏中,并可能由CYP450氧化酶系参与。第三章结合芥子气原型脂库蓄积的特点,有针对性的设计亲脂型清除剂,并利用已建立检测方法,以芥子气皮肤暴露后大鼠体内芥子气、芥子亚砜和芥子砜的含量及动力学参数为评价指标,定量评价亲脂型清除剂的清除效果。结果显示,芥子气皮肤染毒SD大鼠于染毒部位涂抹RSDL后,可有效降低血液及脂肪中芥子气原型及其氧化产物的含量,并且降低芥子气原型及其氧化产物的达峰时间、消除半衰期和平均驻留时间;而非染毒部位涂抹RSDL后,其血液及脂肪中芥子气原型的含量并没有得到降低,但血液和脂肪中芥子亚砜及芥子砜的含量与芥子气染毒不给药组相比有所下降,并且两种氧化产物在血液和脂肪中的达峰时间、消除半衰期和平均驻留时间均有降低;从结果可以看出RSDL原部位给药效果明显,非染毒部位给药效果有限,提示RSDL体外清除要远优于体内清除。通过对N-乙酰半胱氨酸脂溶性衍生物的原位给药实验发现,多数化合物可以起到降低大鼠血液中芥子气原型及其氧化产物的作用,但少数化合物效果相反,会提高血液中三种被测物含量。比较芥子气皮肤染毒尾静脉给药硫代硫酸钠溶液和谷胱甘肽异丙酯后血液中芥子气原型及其氧化产物动力学参数发现,设计的亲脂性化合物谷胱甘肽异丙酯降低血液中芥子气和芥子砜含量的作用明显好于硫代硫酸钠。综合研究结果表明:基于芥子气及其氧化产物含量定量检测的方法,可以准确定量描述体内三种化合物含量变化,并能够作为评价清除效果的指标;RSDL原位涂抹给药效果明显并好于非染毒部位给药,N-乙酰半胱氨酸脂溶性衍生物皮肤涂抹给药具有清除血液中芥子气原型及其氧化产物的作用,静脉注射谷胱甘肽异丙酯的清除效果好于硫代硫酸钠溶液。揭示出亲脂型化合物在芥子气及其氧化产物的清除或治疗方面的优势,且肯定了定量评价药物效果的可行性。第四章通过对RSDL不同给药方式下SD大鼠存活情况研究,结果显示皮肤染毒后原位涂抹RSDL可以明显改善大鼠生存状态,并显著提高存活率,非染毒部位给药虽不能提高大鼠存活率,但可减轻由芥子气暴露引起的如腹泻等症状;尾静脉染毒后皮肤涂抹给药无明显治疗效果。综合大鼠生存状态统计结果,发现RSDL的治疗效果主要表现在皮肤表面的洗消作用,而透皮进入体内后的清除效果并不明显,只可减轻大鼠芥子气暴露后出现的腹泻等症状。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R82

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