人肝脏发育过程中CYP3A基因亚型选择性表达的表观调控机制研究

发布时间：2018-04-18 04:40

本文选题：个体发育 + CYP3A　；参考：《郑州大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景及目的细胞色素P450 3A(Cytochrome P450 3A,CYP3A)是CYP家族中重要的一个亚家族,主要在肝脏和小肠中表达,约有60%以上的临床药物由CYP3A参与催化代谢。CYP3A主要包含CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7及CYP 3A43 4种主要的功能性同工酶,其中CYP3A4主要在成人肝脏中高表达,且存在显著的个体差异;而CYP3A7主要在胎儿肝脏中高表达。对于成年人,基因型和诱导状态是决定CYP3A4表达水平主要因素,而对于儿童人群,发育对药物代谢酶影响可能发挥至关重要的作用。越来越多的研究表明,从胎儿到成人生长发育过程中,CYP3A活性并非呈线性,且变化显著,因此,严重影响儿童患者安全用药。在个体发育过程中,因肝脏CYP3A4和CYP3A7酶活性和基因表达的不同,导致成人和儿童在药物代谢和效应上的显著差异。儿童不是缩小的成年人,用药剂量不能单纯由体重推算出来,否则,必将导致预料之外的严重不良反应的发生。因此,明确发育过程中CYP3A4和CYP3A7基因表达模式的变化,阐明CYP3A基因表达调控的分子机制,对临床儿童患者安全用药具有重要的指导意义。近年来,国内外文献报道均已证实CYP3A5的基因多态性可以部分解释经CYP3A5代谢的药物清除率的个体差异,而CYP3A4和CYP3A7的基因多态性对CYP3A的表型无显著影响。经典遗传学无法解释出生后CYP3A7基因是如何“关闭”和CYP3A4基因是如何“打开”?新近研究表明,基因表达的表观遗传调控对细胞分化和器官发育至关重要。我们前期预实验发现组蛋白H3的4位赖氨酸二甲基化(histone H3K4 di-methylation,H3K4me2)和组蛋白H3的27位赖氨酸三甲基化(histone H3K27 tri-methylation,H3K27me3)的动态修饰模式与CYP3A4/3A7基因发育表达模式有关,提示表观遗传机制可能在CYP3A基因发育表达过程中发挥重要调控作用。在肝脏发育过程中,表观遗传机制如何对CYP3A基因表达的调控发挥重要作用?什么因素决定特定染色质的组蛋白修饰状态呢?哪些核受体特异性地调控CYP3A基因表达?组蛋白赖氨酸甲基化(如H3K4me2)如何参与人类肝脏发育过程中的CYP3A4/3A7基因表达模式的调控?因此,我们提出如下假说:核受体在与CYP3A4/3A7基因的特异性调控序列结合后,募集多种组蛋白的修饰酶,进而改变了与CYP3A4/3A7基因序列相结合的组蛋白的修饰状态,从而达到调控CYP3A4/3A7基因选择性表达的目的。基于以上假设,本研究目的如下:(1)明确人肝脏发育过程中CYP3A4/3A7及相关核受体的基因发育表达模式;(2)阐明人肝脏发育过程中CYP3A4/3A7基因表达与其启动子区组蛋白修饰状态关系;(3)探讨调控CYP3A4/3A7发育开关及选择性表达的特异性关键的组蛋白修饰机制,为指导临床儿童安全用药提供重要理论依据。方法一、体内实验1.研究对象样本均来源于郑州大学第一附属医院,在产科收集53例胎儿肝脏组织样本并经超声诊断确定估计孕龄(estimated gestational age,EGA)为13-38 wks,出生后不同年龄组的肝脏样本97例来源于肝胆外科,以上样本进行所描述的研究。入选本实验研究的病人在研究期间没有服用CYP3A4的诱导剂和抑制剂,肝脏与肾脏功能不全的患者已排除,且排除了乙型、丙型肝炎及HIV感染者。本次研究方案得到郑州大学第一附属医院医学伦理委员会的批准,患者均在实验前签署知情同意书。胎儿肝脏样本分为(13-25wks)、(25-38wks)组;出生后肝脏样本分为0-1yr、1-18yr、成人(18yr)组,13 wks胎儿肝脏样本做为对照。2.CYP3A4/3A7及核受体m RNAs表达的测定提取肝组织总RNA,反转录合成c DNA,以GAPDH作为内参基因,采用SYBR Green方法,应用7500 fast实时荧光定量PCR系统,以2 ΔΔCT方法检测得肝脏组织样本中目的基因m RNA的相对表达量。3.高效液相色谱(HPLC)方法测定CYP3A4/3A7的酶活性差速离心法制备肝微粒体,BCA法测定微粒体蛋白含量,以咪达唑仑和脱氢表雄酮分别作为CYP3A4和CYP3A7的底物,CYP3A4酶活性用1-OH MDZ生成量速度表示,CYP3A7酶活性采用脱氢表雄酮减少速度表示。HPLC方法检测样本中肝微粒体酶活性,用回归分析及Eadie-Hofstee求出表示CYP3A4/3A7酶活性的Km及Vmax。4.Western blotting方法检测CYP3A4/3A7、核受体蛋白表达提取肝组织样本总蛋白,BCA法测蛋白的含量,煮沸变性后上样进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,加入一定稀释比例CYP3A4(1:20000)、CYP3A7兔单克隆抗体(1:5000)、GAPDH鼠单克隆抗体(1:10000),4℃孵育过夜后,加入相应的稀释比例HRP(1:2000)标记的二抗,显色曝光成像后进行光密度积分值分析。5.蛋白质质谱(LC-MSMS)定性分析CYP3A4/3A7蛋白提取胎儿肝脏微粒体样本,进行SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色后脱色,切取含有58 k Da凝胶条,胶内酶解抽提肽段,采用毛细管高效液相色谱方法,进样方式采用Nanospray,正离子是检测的主要内容。多肽及其碎片的质量电荷比:全扫描(full scan)10个碎片图谱(MS2 scan)被采集,获得质谱测试原始文件(raw file)后,应用Mascot2.2软件检索相应数据库,最终得到肝脏微粒体样本的蛋白质检测结果。6.染色质免疫共沉淀与高通量测序(chromatin immunoprecipitation-sequencing,Ch IP-Seq)及生物信息学分析肝脏样本的组蛋白修饰状态将成人及胎儿肝脏样本依照染色质免疫共沉淀的试剂盒说明进行实验,Ch IP DNA送往深圳华大基因公司进行高通量测序(Illumina Hi Seq 2000),包括进行测序前质控,测序文库构建,将测序后获得的数据应用软件SOAP(short oligonucleotide analysis package)与人类基因组序列进行比对,获得唯一比对reads;应用MACS(Model-based Analysis for Ch IP-Seq)方法进行全基因组peaks扫描,获得H3K4me2、H3K27me3 peaks。每个样本Ch IP-Seq结果在UCSC基因组浏览器上进行数据可视化,UCSC Genome Browser(http://www.genome.ucsc.edu).通过数据可视化分析可以得到成人及胎儿肝脏样本差异表达基因不同位点H3K4me2、H3K27me3特异表观修饰的倍比改变,两组之间的比较可通过P-value来确定是否有统计学意义。二、体外实验1.原代胎肝细胞、Hep G2细胞中H3K4甲基化修饰对CYP3A4/3A7基因及相关核受体表达影响分离培养原代胎肝细胞,复苏Hep G2细胞,分别加入不同浓度的pargyline处理48 h后,观察原代胎肝细胞、Hep G2细胞H3K4甲基化修饰状态对CYP3A4/3A7及相关核受体表达影响。2.小RNA干扰(si RNA)干扰沉默核受体基因HNF4A对Hep G2细胞CYP3A基因表达的影响设计合成干扰沉默核受体基因HNF4A的si RNA,分别用不同浓度si HNF4A瞬时转染Hep G2细胞,48 h后收集细胞,提取各组RNA并反转录,realtime q PCR(QPCR)定量检测CYP3A4、HNF4A、PXR基因m RNA表达。3.CYP3A4/3A7基因启动子、增强子区组蛋白甲基化修饰状态对其转录活性的影响用抗H3K4me2抗体及其阴性对照抗体Ig G对3m M pargyline药物处理组与不加药对照组的Hep G2细胞进行Ch IP,形成DNA蛋白复合物洗涤、洗脱后,解交联DNA纯化后,根据Ch IP-seq结果CYP3A4、CYP3A7基因H3K4me2富集位点,结合文献报道HNF4A及GR结合位点,我们选取了特异CYP3A4、CYP3A7的启动子区增强子区位点进行QPCR检测,探讨CYP3A4/3A7发育表达中基因启动子、增强子区组蛋白甲基化修饰状态对其转录活性的影响。统计分析所有数据应用统计学软件SPSS19.0分析,符合正态分布的数据以mean±S.E.表示,采用独立样本t-test,相关分析为pearson相关,P0.05被认为差异有统计学意义。结果1.CYP3A4/3A7及相关核受体m RNAs的表达在人肝脏发育过程中,估计孕龄(EGA)13 wks肝脏可检测到CYP3A7 m RNA的表达,与13wks肝脏组织样本表达量相比,25wks达到最高水平,EGA(25wks)组相对表达量2.31,EGA(25-38wks)组相对表达量2.18,出生后1年表达水平大幅降低,0-1yr组相对表达量0.12,1-18yr继续降低,尤其成人降至最低水平,成人组相对表达量降至0.05。出生前CYP3A4 m RNA表达水平较低,EGA(13-38wks)组相对表达量为2.43,0-1yr组中表达略微升高,相对表达量为4.08,出生后1-18yr组及成人组的表达水平与胎肝组CYP3A4 m RNA表达相比显著升高,相对表达量分别为21.81、10.81,且差异具有统计学意义(P0.001,P0.01)。发育过程中CYP3A表达水平呈现显著的个体差异,分别为成人肝脏组CYP3A4 m RNA变异倍数256倍、胎儿肝脏组CYP3A7 m RNA变异倍数628倍。核受体PXR、CAR、PPARA、HNF4A m RNA成人肝脏组样本中的表达水平显著高于胎儿肝脏组;成人肝脏组样本CYP3A4 m RNA表达与HNF4A、PXR m RNAs表达呈现显著的正相关(R=0.52,P0.01),(R=0.47,P0.01);胎儿肝脏组样本CYP3A7 m RNA表达与GR m RNA呈显著的正相关(R=0.48,P0.001)。2.CYP3A4及CYP3A7酶活性动态变化150例肝脏样本中,在胎儿肝脏组EGA(13-38wks)微粒体CYP3A7活性Vmax为5.90(μmol/min/mg protein),显著高于成人组肝脏微粒体CYP3A7活性Vmax为0.75(μmol/min/mg protein)(P0.001);成人肝脏组微粒体(18-60 yr)CYP3A4活性Vmax为0.26(nmol/min/mg protein),显著高于胎儿肝脏组EGA(13-38 wks)微粒体CYP3A4活性,Vmax为0.04(nmol/min/mg protein)(P0.001);内在清除率(Clint)检测结果显示,在胎儿肝脏及出生后不同年龄肝脏组比较中有类似的发现,但是,CYP3A4催化咪达唑仑及CYP3A7催化DHEA的Km值,在胎儿肝脏及出生后不同年龄肝脏组中差异没有显著性。总之,胎儿肝脏组与出生后不同年龄肝脏组微粒体样本中,CYP3A4/3A7催化活性存在显著的个体差异,CYP3A7尤其显著,微粒体蛋白酶活性范围从0-36.4(μmol/min/mg protein),EGA(24 wks)肝脏微粒体样本CYP3A7活性水平最高。3.胎肝、成人肝脏中CYP3A4/3A7基因发育表达的组蛋白甲基化修饰Switch效应绘制并比较了胎肝及成人肝脏组样本H3K4me2及H3K27me3的全基因组图谱:胎肝和成人肝脏样本之间,基因座上的H3K4me2修饰具有显著差别,H3K4me2富集位点大多在转录起始位点上下游5kb,特别是位于近端启动子区域的H3K4me2修饰,其中与成人肝脏相比,胎儿肝脏组织中CYP3A7基因启动子区H3K4me2高度富集,富集倍比为4.82;与胎儿肝脏相比,成人肝脏组织中CYP3A4、PXR、HNF4A、HNF1A及RXR等基因的启动子区H3K4me2高度富集,富集倍比分别为:4.17、6.81、7.5、5.02、8.74。与成人肝脏相比,胎儿肝脏CYP3A4和CYP3A7间距离CYP3A4的3’端下游约3 kb处的H3K27me3富集,胎儿肝脏HNF4A及RXR 5’端H3K27me3富集。根据生物信息学分析结合本论文第1部分结果,进一步阐明了H3K4me2富集在胎儿与成人肝脏特异高表达基因的启动子区,且富集水平与m RNAs的表达水平完全一致。这些结果提示:在肝脏发育过程中,表观遗传机制可能是通过调节启动子区域的H3K4me2修饰水平,进而调节基因启动子的活性促进基因的表达。4.si RNA干扰沉默核受体基因HNF4A对CYP3A4/3A7基因表达的影响si HNF4A可降低HNF4A m RNA的表达水平且呈浓度依赖,80 n M处理组与对照组相比表达水平下降了78%。HNF4A可靶向作用于CYP3A4、PXR,从而降低其表达水平,80 n M si HNF4A处理组与对照组相比,CYP3A4、PXR m RNA的表达水平分别下降了75%、76%。5.CYP3A4/3A7基因启动子区、增强子区组蛋白修饰状态对其转录活性的影响LSD1抑制剂pargyline能促进原代胎肝细胞及Hep G2细胞的增殖生长,且促进原代胎肝细胞CYP3A7、FOXA3、ALB、AFP基因表达;促进Hep G2细胞CYP3A4、CYP3A7基因表达。在CYP3A4近端的启动子区(-362~+53)及增强子区(-7836~-6093)转录因子HNF4A结合位点H3K4me2富集情况如下,pargyline未处理组H3K4me2部分修饰,处理组均表现H3K4me2高度修饰,而在阴性对照组Ig G中,几乎不发生H3K4me2的富集;CYP3A7的启动子区(-163~+103)及增强子区GR的结合位点(-4054~-3421)(-6265~-6247)H3K4me2富集情况:pargyline未处理组H3K4me2部分修饰,处理组均表现H3K4me2高度修饰,而在阴性对照组Ig G中,几乎不发生H3K4me2的富集。LSD1抑制剂直接导致CYP3A4、CYP3A7启动子区H3K4me2富集水平升高,上调了基因表达,充分说明了动态的H3K4me2修饰标志对CYP3A4/3A7基因发育表达的重要性。结论1.CYP3A4/3A7发育表达模式:CYP3A7、CYP3A4分别是胎肝、成人肝脏主要表达亚型;发育开关表型转换:CYP3A7表达水平在出生1年后急剧下降,CYP3A4表达儿童期才能达到较高水平。2.人肝脏发育过程中CYP3A4/3A7选择性表达与其启动子区组蛋白H3K4me2、H3K27me3动态修饰相关。HNF4A调控成人肝脏中CYP3A4的基础表达及GR调控胎儿肝脏中CYP3A7的表达均发挥决定性作用,其表观遗传调控机制与HNF4A、GR和CYP3A启动子区及增强子区的高度富集H3K4me2有关,从而促进CYP3A基因的转录。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：D919

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