巨噬细胞对血管细胞的辐射旁效应及其分子机制研究

发布时间：2018-04-30 17:24

本文选题：辐射旁效应 + U937　；参考：《复旦大学》2014年博士论文

【摘要】：电离辐射能够导致动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)首次报道于1959年。辐射和高血压、高血脂、吸烟、糖尿病、肥胖、缺乏运动以及年龄等均是AS的独立危险因素。电离辐射和其它的危险因素一起共同作用于动脉血管,可加速AS的形成。AS主要累及大中型动脉,引起不同程度的血管管腔堵塞,使受阻动脉远端缺血而导致局部组织坏死。动脉粥样硬化会导致冠心病,如果冠状动脉狭窄达50%,临床可出现因心肌缺血或坏死而引起的心绞痛、急性心肌梗死和心律失常等严重疾病。电离辐射能直接导致受照射细胞损伤,受照射的细胞可以通过细胞介质或细胞间隙连接通讯,将应答反应传递至未接受电离辐射的正常细胞,使正常细胞也出现与受电离辐射类似的生物学损伤反应,这种现象称为辐射旁效应。随着放射治疗肿瘤技术广泛推广,肿瘤患者接收放疗后的远后生存成为热点,因此不仅需要关注辐射直接导致的损伤,辐射旁效应所导致的远后期损伤也逐渐受到关注。有研究表明辐射导致的动脉粥样硬化以及并发的心脑血管疾病而导致的死亡是放射治疗肿瘤患者除患癌死亡以外最多见的并发症,但是电离辐射导致心血管疾病的机制还不清楚,虽然它与年龄因素导致的动脉粥样硬化是不同的。随着全球受到环境和人工辐射人群的渐渐增多,需要去了解电离辐射诱发的动脉粥样硬化的机制,为预防电离辐射诱发的心血管疾病提供实验基础。对于放射治疗来说,绝大部分为身体局部受到照射,局部受照区域血管内的单核/巨噬细胞受照射,而巨噬细胞是人体重要的免疫细胞,受到辐射后会有释放大量生物活性因子,导致辐射旁效应。因此深入了解电离辐射诱发的动脉粥样硬化,以及辐射旁效应在辐射动脉粥样硬化中作用为我们的防护工作提供新的思路。本论文通过照射U937单核巨噬细胞,并将受照射的U937细胞和未受照射的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立共培养的模型,发现受照射的U937细胞可导致未受照射HUVECs的DNA损伤暨微核形成,受照射后的U937细胞上清中的NO浓度增加,细胞内的iNOS蛋白表达增加。用不同浓度的外源性NO供体SNP处理HUVECs也导致其微核增加,微核率与SNP浓度有关,而加入NO清除剂c-PTIO能够减少SNP诱导的微核形成。iNOS抑制剂SMT预处-U937细胞,或者在共培养的体系内加入NO清除剂c-PTIO,均能够抑制HUVECs旁细胞的微核生成。同时受照射的U937细胞能够导致未受照射的HUVECs凋亡率显著提高、克隆形成率明显降低。而SMT预处理U937和c-PTIO处理共培养的两种细胞后,能够完全抑制受照射U937诱发的HUVECs的凋亡,部分恢复了HUVECs的存活率。提示受照射的U937细胞能够通过iNOS激活释放NO,诱发共培养的HUVECs产生DNA损伤、凋亡等辐射旁效应。另外,]HUVECs旁细胞的P38蛋白磷酸化显著增加,p38抑制剂SB203580处理未受照射的HUVECs后,DNA损伤、细胞凋亡等辐射旁效应明显减弱,而细胞存活率显著增强。同时,受照射U937细胞还使得与之共培养的HUVECs细胞膜表面VCAM-1的表达增加,使其与U937细胞的粘附能力显著增强。然而SMT和c-PTIO能够抑制HUVECs的VCAM-1的表达,由于VCAM-1表达是调节单核巨噬细胞和HUVECs粘附的重要分子,因而NO抑制剂降低了HUVECs细胞与受照射U937细胞的粘附。当用SB203580预处理HUVECs细胞,再与受照射的U937细胞共培养,HUVECs细胞的VCAM-1的表达完全受抑制,与受照射的U937细胞粘附降低至本底。受照射U937细胞还可明显促进HUVECs释放活性MMP-9和MMP-2。但是当受照射的靶细胞U937受到SMT、c-PTIO的处理,或者HUVECs旁细胞受到SB203580预处理后,HUVECs细胞释放活性MMP-9与MMP-2的能力显著下降。这些结果揭示,受照射的U937细胞通过激活iNOS的表达并释放大量的NO,进而激活与之共培养的未受照射的HUVECs产生一系列炎症相关的旁效应,其中p38/MAPK通路发挥了重要作用。在上述发现的基础上,我们研究了受辐射巨噬细胞对血管平滑肌细胞HUSMC的远程旁效应,暨对增殖和迁移能力的影响。血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化过程中起着重要作用。利用Transwell小室建立了两种细胞共培养的模型。一是受照射U937细胞和未受照射的HUSMC共培养：U937细胞种植与小室内,HUSMC种植于六孔板；另一个是受照射U937细胞和未受照射的HUSMC 、 HUVECs共培养：U937悬浮细胞种植于小室内,HUVECs种植于小室上,]HUSMC种植于六孔板内。发现受照射的U937细胞通过释放的细胞因子TNF-a等促进HUSMC增殖。在两细胞共培养体系中的HUSMC的增殖能力比三细胞共培养体系中的HUSMC增殖能力强。而用外源性TNF-a处理HUSMC,可增加该细胞IL-6 mRNA表达。在两细胞和三细胞共培养体系中,受照射U937细胞能够导致共培养体系条件培养液中MCP-1、IL-6显著增加。两细胞体系与三细胞体系相比,HUSMC的MCP-1、IL-6基因表达明显增加,但是上清中的IL-6含量三细胞体系高于两细胞体系；两细胞体系上清中的MCP-1含量高于三细胞体系。说明IL-6释放有部分是来自于共培养体系中的HUVECs。MCP-1主要来自于HUSMC共培养体系中的炎症因子TNF-α。概括而言,本文研究表明：受照射的巨噬细胞能导致共培养的内皮细胞受损,内皮细胞与巨噬细胞的粘附能力增强。此过程与内皮细胞分泌的NO有关。而受照射的U937细胞能够导致未受照射的HUSMC的增殖能力增强。在这些过程中,一系列炎症因子参与其中。这些实验证实了辐射旁效应能够导致内皮细胞的损伤,平滑肌细胞增殖和迁移能力改变。本文研究结果提示,辐射旁效应可能参与了辐射诱导的动脉粥样硬化。
[Abstract]:Radiation and hypertension , hyperlipidemia , smoking , diabetes , obesity , lack of movement , and age are the independent risk factors of AS . The expression of VCAM - 1 and MMP - 2 in vascular smooth muscle cells were significantly inhibited by irradiation with SB203580 .
In the co - culture system , the expression of MCP - 1 and IL - 6 in the culture medium of the two - cell co - culture system was higher than that in the three - cell co - culture system , but the expression of MCP - 1 and IL - 6 in the culture medium of the two cells was significantly increased .
MCP - 1 in the supernatant of the two - cell system is higher than that of the three - cell system . It is indicated that IL - 6 release is partly derived from the co - culture system . MCP - 1 is mainly derived from the inflammatory factor TNF - 伪 in the co - culture system of HUSMC . The study shows that the irradiated macrophages can lead to the injury of the endothelial cells , the proliferation of smooth muscle cells and the change of migration ability . The results suggested that the radiation - side effect might be involved in the radiation - induced atherosclerosis .

【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R818

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