辐射损伤代谢标志物筛选及mACON对辐射敏感性的影响研究

发布时间：2019-01-01 09:52

【摘要】：在核与辐射事故病人医学救治处理过程中，受照剂量估算最常用的检测手段仍然是细胞遗传学方法——淋巴细胞染色体畸变分析。该方法虽然准确，但操作较繁琐和费时，在处理大批量伤员时有明显的局限性。随着国际反恐与核威胁形势的需要，建立快速、高通量的生物剂量检测方法用来快速筛检批量受照伤员十分必要。应用高通量、非侵袭性、快速的代谢组学技术寻找生物标志物用于评估大量人群受照剂量的研究具有重要的意义。本研究采用代谢组学气相色谱飞行时间质谱(GC/TOFMS)技术匹配主成分分析(PCA)方法，研究不同剂量γ-射线照射大鼠血清中的代谢产物变化，以筛选可用于辐射损伤诊断和剂量估算的生物标志物。将SD大鼠分别给予0.75Gy、3Gy和8Gy(剂量率为1.9Gy/min) γ-射线全身照射或者假照射，受照后24小时立即收集血清样本用于GC/TOFMS分析，多变量数据分析采用主成分分析法。结果表明，大鼠受到不同剂量γ射线照射24小时后，血清中代谢物组成产生了明显不同的代谢表型，这将有助于建立快速筛查受照人群的模式，以便使受照者尽早接受治疗。色谱分析揭示了9种血清代谢物在照后发生了显著改变，，上升的代谢物包括肌醇、丝氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸和甘油，下降的代谢物包括异柠檬酸、葡糖酸和硬脂酸。这些差异代谢产物有望成为新的辐射损伤标志物，同时可以从这些差异代谢物的角度探索辐射损伤的机制，可能成为放射医学基础研究的新视角。在上述研究的基础上，结合文献调研发现，线粒体顺乌头酸酶（MitochondrialAconitase，mACON）具有调节异柠檬酸在三羧酸循环中含量的重要作用，而且mACON在耐辐射细菌基因组及骨骼肌、心肌等辐射不敏感组织中呈明显高表达，在辐射敏感组织中呈低表达，为此我们设想照射后mACON的低表达和活性下降可能会影响电离辐射后细胞损伤的修复，也可能是电离辐射诱导细胞凋亡的原因。为了验证mACON在电离辐射诱导细胞损伤中的作用及分子机制，我们首先构建mACON慢病毒干涉和表达载体，并制备了干涉和表达mACON慢病毒颗粒。慢病毒干涉颗粒感染HEK293、U937和HeLa三种细胞，经流式细胞仪分选后，建立起荧光稳定表达的细胞系。与空载细胞相比，干涉细胞系HEK293、U937、HeLa细胞中mACON的mRNA表达水平分别下调为空载细胞的16%、22%和32%，其mACON的蛋白表达水平有效减少，成功的构建了三种干涉细胞系。同时，HEK293、U937、HeLa表达细胞系中的mACON的mRNA表达水平与空载细胞相比，分别上调至2.8倍、2.0倍和12.0倍。其mACON的蛋白表达水平明显增加，表明三种表达细胞系成功。随后，选用HeLa干涉细胞系利用流式细胞方法研究mACON下调后对电离辐射诱发细胞周期阻滞影响。结果表明，Hela细胞经2Gy60Coγ射线照射后，随时间的增加而出现G_2/M期阻滞。HeLa-pSicoR1408细胞G2/M期比例不仅显著低于HeLa-pSicoR细胞（P0.01），而且其G2/M期峰值出现较对照细胞晚。同时利用U937表达细胞系初步研究mACON上调后对电离辐射损伤后细胞早期凋亡水平的影响。当U937细胞受到照射后24h，U937-mACON2细胞的早期凋亡水平与对U937-pBPLV细胞相比有所下降，而且在10Gy剂量水平上有显著性差异（P0.05）。这些结果提示mACON下调后抑制电离辐射诱发的G2/M期阻滞，细胞DNA损伤修复能力降低，提高细胞辐射敏感性；mACON上调后，电离辐射诱发的细胞早期凋亡比例减少，mACON初步显示出一定的抗凋亡作用。这些研究为我们从代谢物角度阐述辐射损伤机理及影响辐射敏感性差异的机制奠定了一定的理论基础。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R818

【参考文献】