模拟微重力对EPO诱导的K562细胞向红系分化的影响及机制研究

发布时间：2019-03-31 19:44

【摘要】：研究背景随着航空航天事业的发展,人类向空间领域的开发和竞争越来越激烈,2003年,“神州”五号载人飞船发射成功,揭开了中国载人航天工程的新篇章,2008年,“神州”七号成功发射,我国宇航员实现了首次太空出仓活动。在航空事业繁荣进步的同时,人们也开始越来越关注空间飞行对航天员的影响,人类在太空飞行后出现红细胞数量下降是研究空间血液学的核心问题。早期的航天医学家们对1960-1990年美国和前苏联的宇航员研究发现,其血液系统的改变主要表现为血红蛋白总量、红细胞数量、红细胞体积下降和网织红细胞数量升高,他们称之为“航天飞行性贫血”(spaceflight anemia),并且这种血液学改变可以随着飞行时间的延长而变得更加明显。这不仅不利于航天员们完成航天飞行任务更对其血液系统造成了潜在的的危害。于是“航天飞行性贫血”出现的原因和防止措施成为当前空间血液学研究的热点。模拟微重力与红系分化有研究发现,模拟微重力可以抑制UT-7/EPO细胞的增殖,可能是通过激活caspases-3和下调抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达而引起细胞凋亡所导致的,在我们的前期研究发现,模拟微重力可以通过影响ERK1/2蛋白的磷酸化,使细胞停滞在G0/G1期,从而引起增殖障碍。在模拟微重力下UT-7/EPO细胞表面EPOR的表达也出现下调。我们实验室的前期研究发现,模拟微重力可以通过抑制脐血分选的CD34+细胞内GATA-1的mRNA的表达影响其向红系的分化。在RCCS中培养的骨髓CD34+细胞在2-3天时迁徙能力下降,主要表现为对SDF-1a的趋化反应下降,与SDF-la趋化作用相关的细胞骨架也发生了变化,其中细胞骨架中的F-actin的表达下降,同时淋巴细胞和成骨细胞的迁徙能力也受到抑制,并伴有细胞骨架的改变,这可能是外周血细胞减少的原因之一。综上可见,模拟微重力可以通过多种途径影响红系的增殖与分化,导致出现“贫血”症状,其具体机制的研究是目前该领域的一个热点问题。红系分化是一个非常复杂的过程,红细胞的生成是由造血干细胞分化为多向祖细胞,再不断增殖逐步分化为红系祖细胞、红系前体细胞,最后发育成具有生理功能的成熟红细胞。正常地面环境下,红细胞的数量是由生成和凋亡维持着动态平衡的,为保持红系各阶段增殖与分化,生长与调亡之间的平衡,必须要有一个稳定的造血微环境,这包括微血管系统,神经、网状细胞,基质及基质细胞分泌的细胞因子等,其中细胞因子在参与造血调控的过程中可分为正调控和负调控,前者包括干细胞因子(SCF)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、集落刺激因子(GM-CSF、G-CSF)及大多数白细胞介素(IL)等,后者包括干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)及转化生长因子p(TGF-β)等。而红细胞的存活、增殖、分化、成熟主要由促红细胞生成素(EPO)参与完成。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是一种重要的红系干细胞造血因子,主要由肾脏产生,它在缺氧的情况下会大量生成,通过激活多条信号通路参与红系分化为成熟红细胞,通过防止细胞凋亡促进红系祖细胞增殖。当EPO与EPO受体(Erythropoietin receptor, EPOR)相互作用后,可以使EPOR形成二聚体,随后使JAK2酪氨酸激酶磷酸化,激活多条信号通路,发挥生物学效应。有研究表明,在缺失EPO和EPOR基因敲除的小鼠胎肝细胞内,其红细胞集落形成单位(CFU-E)和爆式红系集落形成单位(BFU-E)与正常细胞数量相同,但却不能进一步分化为含有血红蛋白的红细胞,即成熟红细胞,这说明EPO和EPOR可能在红系祖细胞终末分化期中起促进红细胞分化和成熟的作用。 EPOR属于Ⅰ型单跨膜细胞因了受体超级家族成员,由507个氨基酸组成,包括胞外区、跨膜区和胞质区。当EPO与EPOR作用后,激活的EPOR可以和另一个EPOR单体形成EPOR复合二聚体,并选择性的和JAK2酪氨酸激酶结合,JAK2酪氨酸的Y1007被磷酸化而激活,从而伴随着多种酪氨酸蛋白的磷酸化,包括JAK2本身,STAT蛋白、SHIP-1、SHC、Vav、Gab1、Gab2、SYK、SHIP、 IRS-2以及EPOR等,当它们相继磷酸化后,即可分别激活各自所在的信号通路,参与红系增殖与分化。其中参与红系分化中研究和报道较多的为PI3K/AKT信号通路。3-磷酸肌醇激酶(PI3K)是一种广泛存在于人体大多数组织细胞的激酶,也存在于人红白血病细胞K562细胞的细胞膜上。经典的PI3K由p85调节亚基和p110催化亚基组成,可编码至少7种适配蛋白或者调节蛋白。PI3K可通过其p85调节亚基的SH2区与EPOR的Tyr479相结合,这种结合被认为是调控红系祖细胞增殖、分化和成熟的重要的信号通路的起始。激活的PI3K可产生两种脂质体(PI-3,4-P2和PI-3,4,5-P3),作为第二信使激活AKT。AKT是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,又名蛋白激酶B,在哺乳动物体内有广泛的表达。在K562细胞,AKT主要位于细胞质中。AKT通过它的NH2结构区域与磷酸化的PI3K脂质体在细胞膜上相结合,之后AKT的苏氨酸308可通过磷酸依赖激酶1(PDK1)磷酸化而被激活,它的丝氨酸473则被EPO磷酸化,当这两个位点都被磷酸化后,AKT即被完全激活,激活的AKT通过核转位从细胞质内转入细胞核内参与下一步的信号转导,AKT介导的信号通路主要参与细胞存活、增殖与抗凋亡。研究表明,激活的P13K/AKT通路可以进一步激活红系转录因子GATA-1而参与红系的增殖和分化。 GATA-1是红系祖细胞分化晚期表达的一个重要转录因子,它属于锌指结构转录因子家族,该家族包括多个成员,其中GATA-1、GATA-2和GATA-3为基础造血因了。GATA-1主要表达于红细胞、巨核细胞和肥大细胞系,它以三利,方式参与转录调控：结合于启动子上参与转录复合体组成；结合于增强子上加强启动子活性；在红系细胞中作用于珠蛋白基因的启动子和增强子,α、β珠蛋白基因座控制区等。GATA-1在红系祖细胞早期阶段可明显促进红系增殖,而在红系祖细胞晚期阶段是其分化、发育和成熟不可或缺的重要因子。在红系分化晚期,GATA-1的表达量也会下降,这可能是由于在红系分化早期阶段GATA-1的表达量已经足以维持最终生成成熟红细胞的量了,其自身便不在产生,于是随着红系的不断分化GATA-1也不断被消耗,其表达量逐步下降。GATA-1可以促进内源性GATA-1、EKLF、β珠蛋白以及est-1基因等的表达,同时内源性的EPOR表达也会升高。这些红系基因表达的程度均与EPO信号通路相关,一组研究则发现,PI3K/AKT是GATA-1在EPO诱导的K562细胞向红系分化、成熟中的重要通路,在EPO的作用下,GATA-1的S310残基可以通过磷酸化而激活,激活后的GATA-1具有生物学功能,在几乎所有的红系表达基因编码的珠蛋白调节区均可发现GATA-1结合的基因序列,并且,GATA-1还可通过调节Bcl-xL的表达量而发挥抗凋亡作用,以上均表明GATA-1在红系增殖和分化中都扮演了重要的角色。研究目的模拟微重力是否是通过影响EPOR受体形成、PI3K/AKT信号通路及其下游的GATA-1等与红系增殖、分化相关的因素的表达来影响EPO诱导的K562细胞向红系分化的呢?目前尚未见相关报道。研究方法本实验利用旋转式细胞培养系统(Rotary Cell Culture System, RCCS4)模拟微重力,以K562细胞建立红系分化模型,研究模拟微重力对K562细胞向红系分化的影响及其机制,具体技术路线为：(1)我们首先用rhEPO诱导K562细胞向红系分化,建立红系分化模型,用联苯胺染色和流式细胞学技术检测K562细胞血红蛋白表达情况及细胞表面EPOR和CD71的表达情况(2)再用RT-PCR检测不同培养环境下K562细胞内GATA-1、EPOR、β-globin的mRNA表达水平(3)同时用western-blot方法检测K562细胞内AKT、GATA-1的蛋白表达情况,初步探索模拟微重力影响K562细胞向红系分化的机制。研究结果及结论我们的研究发现,模拟微重力能抑制rhEPO诱导的K562细胞向红系分化,表现为联苯胺染色阳性细胞比例下降,CD71和EPOR表达量下降,并且可诱导细胞凋亡：模拟微重力也抑制K562细胞内与红系分化相关的GATA-1、EPOR、 β-globin的mRNA表达水平。同时还发现,介导红系分化的PI3K/AKT通路中AKT及其下游的GATA-1蛋白水平在模拟微重力下表达量降低,这些结果可能为研究“航天飞行性贫血”提出一些新的思路。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R85

【二级参考文献】