18SrDNA克隆文库联用扫描电镜检测滇池水域硅藻种群多样性研究

发布时间：2020-03-19 22:05

【摘要】：[目的]利用18SrDNA克隆文库联用扫描电镜检测滇池不同水域硅藻种群分布特征,用于法医学溺死鉴定。[方法]应用Power Soil DNA Isolation Kit提取滇池水样中的硅藻DNA,然后针对滇池硅藻种群利用Primer Premier 5.0软件设计硅藻18SrDNA引物,并与文献报道的两对硅藻18srDNA特异性引物A145F/Dia516R及通用性引物18sF/18sR,分别对滇池水域中的硅藻18srDNA进行PCR扩增、克隆和测序检测,并比较其特异性与敏感性,筛选出适合作为滇池水域的硅藻DNA扩增及检验的备选引物。在滇池设立6个采集点采集水样,用上步筛选的引物对滇池6个采水点水样总DNAPCR扩增,构建硅藻18srDNA克隆文库,随机挑取克隆子进行测序,在NCBI数据库进行序列比对,分析滇池硅藻种群分布。之后应用扫描电镜检测滇池硅藻种群,对比两种检测方法的结果,并编集滇池水域硅藻种群扫描电镜图谱。[结果](1)Power Soil DNA Isolation Kit能够有效提取水样中的硅藻DNA,且DNA纯度高,可直接用于下游实验。(2)引物筛选,特异性强弱依次是605F/605R,467F/467R,18sF/18sR,A145F/Dia516R,其敏感性强弱依次是 605F/605R,18sF/18sR,467F/467R 和A145F/Dia516R。(3)18SrDNA克隆文库检测滇池6个采集点水样,检出冠盘藻属、等片藻属、直链藻属、菱形藻属、小环藻属、海链藻属、脆杆藻属、舟形藻属、异极藻属、曲壳藻属、楔形藻属11个硅藻种属。(4)扫描电镜检测滇池6个采集点水样,检出冠盘藻属、等片藻属、直链藻属、菱形藻属、小环藻属、脆杆藻属、舟形藻属、异极藻属、曲壳藻属、弯楔藻属、桥弯藻属、卵形藻属、针杆藻属、平板藻属14个硅藻种属。[结论](1)试剂盒Power Soil DNA Isolation Kit能够有效提取水样中的硅藻DNA,18SrDNA克隆文库法用于水样硅藻种群分析效果好,此法要用于水中尸体溺死诊断还需深入研究探索。(2)引物605F/605R适合作为滇池水域的硅藻DNA扩增及检验的备选引物。(3)滇池全湖检出15类硅藻,包括冠盘藻、等片藻、直链藻、菱形藻、小环藻、海链藻、脆杆藻、舟形藻、异极藻、曲壳藻、弯楔藻、桥弯藻、卵形藻、针杆藻、平板藻,不同水域硅藻种群存在一定差异。
【图文】：

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逦昆明医科大学硕士研究生学位论文第二部分１８ｓｒＤＮＡ克隆文库解析滇池通过上一章对滇池硅藻１８ｓｒＤＮＡ引物的设计的引物６０５Ｆ／６０５Ｒ。本章将运用该引物对滇池水域期获得滇池水域硅藻种群多样性的初步信息，对滇法医学溺死诊断以及溺水地点推测提供参考，也为分子鉴定结果的一致性与差异性提供依据。逡逑１材料与方法逡逑１．１样本采集逡逑１．邋１．１采样时间与采集地点逡逑在滇池设置６个水样采集点：海埂北侧的草海观音山（３）、东大河湿地公园（４）、捞鱼河湿地公见图５。采集时间：２０１７年３月２２日。逡逑

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滇池６个采集点水样运用Ｐｏｗｅｒ邋Ｓｏｉｌ邋ＤＮＡ邋Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ试剂盒提取水样逡逑总ＤＮＡ，并运用滇池硅藻１８ｓｒＤＮＡ特异性引物６０５Ｆ／６０５Ｒ邋ＰＣＲ扩增得到预期目标逡逑片段，片段大小约４００ｂｐ，如图６。逡逑２５０ｂｐ逡逑５00ｂｐ逡逑７５０ｂｐ逡逑ｌＯＯＯｂｐ逡逑图６滇池６个水样采集点硅藻１８ｓｒＤＮＡ扩增结果逡逑（从左至右依次为：ｍａｋｅｒ，水样１号至６号）逡逑２．逦２滇池硅藻种群多样性逡逑６个硅藻１８ｓｒＤＮＡ克隆文库各挑取４０个克隆子载体引物扩增测序，共获得逡逑１９６个ＤＮＡ序列，通过Ｂｌａｓｔ与ＮＣＢＩ核酸数据库进行比对，按照相似度最近的逡逑藻类统计数据，，见表９。１９６个序列中有１６７个硅藻序列，包括冠盘藻属、等片逡逑藻属、直链藻属、菱形藻属、小环藻属、海链藻属、脆杆藻属、舟形藻属、异极逡逑藻属、曲壳藻属、楔形藻属１１个娃藻种属。６个米集点间检出娃藻种群存在差逡逑异，海埂北侧的草海水样检出冠盘藻、小环藻、海链藻、舟形藻、菱形藻、脆杆逡逑２７逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：D919

【参考文献】