外泌体miR-1246介导辐射诱导旁效应基因组损伤及其机制研究

发布时间：2020-04-17 00:42

【摘要】：【目的】研究正常细胞受电离辐射后分泌出外泌体(exosomes)中miR-1246等miRNA分子的表达变化及其进入未受照细胞中造成的基因组损伤效应和作用机制。【材料和方法】取对数期生长的正常人肺支气管上皮细胞BEP2D,分为照射组和非照射组,给予2Gy的~(60)Co-γ照射,继续培养4hr和8hr后收集无细胞培养液,超速离心法分离获取外泌体,提取exosomes中的RNA,进行miRNA基因芯片检测分析差异表达miRNA分子,选择表达上调明显的miR-1246进一步研究。采用受照细胞的条件培养液及外泌体转移的方法,以微核(MN)、DNA双链断裂分子标志物53BP1 foci、彗星为生物终点检测各处理因素诱导未受照支气管上皮细胞BEP2D的基因组DNA损伤,据此了解外泌体介导的辐射旁效应。然后观察经转染miR-1246的模拟物(mimic)或抑制剂,进一步考证外泌体miR-1246诱发细胞基因组DNA损伤,即微核(MN)、53BP1 foci、彗星等指标的变化;利用流式细胞术、CCK-8试剂盒、克隆形成检测细胞凋亡及细胞增殖变化;TargetScan在线预测miR-1246的靶基因,对其中的靶基因——DNA双链断裂的非同源末端修复(NHEJ)通路中关键修复基因连接酶4(LIG4)作进一步的影响机制研究;实时定量PCR、Western blot分别在mRNA、蛋白水平上检测miR-1246与LIG4的关系,双荧光素酶报告基因检测miR-1246与LIG4 mRNA的3’非翻译区(3’UTR)靶序列的直接相互作用;;利用转染NHEJ-GFP、P-cherry质粒报告系统及流式细胞分析检测miR-1246对NHEJ修复效率的影响,进一步探讨miR-1246介导辐射诱导的细胞基因组损伤修复的相关机制。【结果】通过基因芯片分析,从2Gy照射BEP2D细胞的培养液中分离出外泌体中,鉴定了多个受辐射诱导表达的miRNA分子,其中包括miR-1246;相对于对照细胞的培养液,用2Gy照射细胞后4h、24h收集的条件培养液培养培养RCCM正常的BEP2D细胞,诱发细胞微核、53BP1 foci、彗星形成率等基因组DNA损伤指标显著增加。用照射细胞的外泌体处理正常细胞,同样显著增加细胞的基因组DNA损伤。。用miR-1246处理正常培养的BEP2D细胞,,也相应地显著增加微核、53BP1 foci、彗星的产生,并且存在剂量效应,同时导致细胞增殖能力下降,但是其凋亡,周期未发生明显变化。miR-1246抑制剂能够显著减轻受照细胞分泌外泌体和条件培养液RCCM的对未照射细胞的基因组DNA损伤效应;miR-1246 mimic在mRNA、蛋白水平抑制了细胞LIG4的表达,以及LIG4 mRNA 3’UTR活性,导致DNA双链断裂的NHEJ通路修复效率显著降低。【结论】电离辐射导致BEP2D细胞分泌的外泌体中miR-1246表达水平显著增减,其进入未照射的细胞中诱发基因组DNA损伤,其作用机制与miR-1246靶向抑制DNA修复基因LIG4的表达密切相关。该研究为阐述电离辐射旁效应机制提供了新的机理解释。
【图文】：

图 1 BEP2D 细胞分泌外泌体的电子显微镜下鉴定体中 miRNA 表达谱的变化射 BEP2D 细胞，在照射后 4h、8h 分别收集照射细胞和对体，进行了 miRNA 芯片分析。通过芯片筛查由辐射诱导A，发现细胞受照射后的外泌体中 miRNA 表达有升高的，，示外泌体中 miRNA 表达谱聚类分析的一部分 miRNA 分的是照射后 4h 和 8h 的外泌体中共同差异表达的 miRNANA-7-5p 和 miRNA-1246。表 1 列出了照射后 4h 表达水平具有统计学显著性（p < 0.05）的 miRNA 分子，且受照细大于 500，共鉴定了 16 个表达显著上调的 miRNA 分子

图 3 qRT-PCR 检测细胞内或外泌体 miR-1246 的表达变化A．2Gy 照射后不同时间点细胞内 miR-1246 的表达B. 2Gy 照射后不同时间点收集培养液提取外泌体中 miR-1246 的表达C. 不同时间点收集的外泌体被受体细胞摄取后 miR-1246 的表达3.5 辐射诱导外泌体 miR-1246 介导旁细胞基因组 DNA 损伤为了探索外泌体中的 miR-1246 介导旁细胞基因组损伤，我们用 2Gy 照BEP2D 细胞后分别在 4h、24h 收集培养液（RCCM），培养液转移法培养 BEP细胞，微核试验检测其旁基因组损伤。图 4A 显示，相对于未照射细胞的培养CCCM，来自受照细胞的条件培养液 RCCM 培养的 BEP2D 细胞的微核率显著加。为了进一步证明 miR-1246 介导辐射诱导旁基因组损伤，2Gy 辐射细胞后集培养液，培养液转移法后，转染 miR-1246 inhibitor、miR-NC，微核试验检其旁基因组损伤情况，如图 4B 显示转染 inhibitor 显著抑制了 RCCM 所致 BEP
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R818

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本文编号：2630237