环介导等温扩增和荧光共振能量转移检测核酸及其在体育科研中的应用

发布时间：2020-04-18 03:47

【摘要】：核酸是生物遗传信息载体,其完整性对生物生存和正常繁衍至关重要。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)和基因损伤的分析检测在当前生化研究和临床诊断等领域具有重要的意义,开发简便、快速、高灵敏和特异性好的核酸检测新方法具有广泛的应用前景。论文主要应用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)、荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)等技术,研究开发了高灵敏度检测DNA SNP和氧化损伤水平的新方法,并在耐力水平评价、运动遗传病预防等多个体育科研领域中的应用进行了研究,主要内容如下:1、基于连接酶LAMP技术建立了检测运动员耐力杰出型基因ACTN3 SNP的新方法。方法设计了与目标DNA序列互补的茎环结构探针,利用探针连接反应引发LAMP反应,采用SBYR Green I染料对双链DNA进行实时荧光定量检测,根据POI值(实时荧光曲线中的最大斜率对应的时间)差异实现ACTN3基因SNP的高灵敏度分型。此方法对DNA定量检出限为100 aM,可测定0.1%突变频率,同时应用于人全血基因组DNA样品检测获得了与DNA测序一致的结果。2、基于上述连接酶LAMP原理,采用CE实现在单个反应体系中同时检测多个耐力基因的SNP位点。在反应过程中,在一条引物上标记荧光基团;针对不同SNP位点,设计具有不同长度的连接探针,连接反应准确区分碱基错配,LAMP反应后产物进行酶切,荧光产物通过SeqStudio~(TM)基因分析仪的CE分离和激光诱导荧光检测,进行片段分析,根据不同长度的荧光产物来进行4种SNP类型的区分,方法对DNA检出限低至2 aM。3、基于阳离子共轭聚合物PFP FRET原理建立了一种检测DNA氧化损伤水平的新方法。该方法通过DNA修复酶处理氧化损伤DNA样品获得3'-5'磷酸核苷酸间隙,用DNA聚合酶标记荧光,再加入PFP获得PFP-DNA复合物,通过FRET检测DNA的氧化损伤水平。实验结果表明,该方法具有较高的灵敏度和特异性,人基因组DNA的检出限为1ng/μL。与现有方法相比,该方法解决了DNA损伤检测步骤繁琐、灵敏度低、选择性低的缺点,在临床医学检测中具有良好的应用前景。
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机理,比值,长跑训练,位点

第一章引言运动员和普通人群中分布特征，分析基因多态性与长跑训练前后生理指性，利用基因重组和细胞转染研究 Glut4 基因启动子区与有氧能力关联的带不同等位基因的启动子，分析其与长跑能力相关性。实验结果表明，Ars2796516 位点 G 等位基因、rs2746342-rs11206889 位点 AC 单体型等基因跑运动员的分子标记。

小鼠模型,有氧能力,遗传度,种族差异

图 1-2 ACTN3 / 小鼠模型的建立及分析[34]大有氧耐力的遗传度为 30%-80%，至今共发现 49 个与耐力素质部分位点由于受样本量、种族差异、地域差异等影响，其确切效们普遍认为，基因突变可能在很大程度上可以解释人体有氧能力肉力量、有氧能力类型、体成分和不同基因的多态性有显著相关
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;R87

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