辐射诱导DNA损伤修复中EZH2与ATM调控作用的研究

发布时间：2020-05-14 09:24

【摘要】：背景:电离辐射(ionizing radiation,IR)引起的DNA损伤是辐射损伤效应的重要内容之一,也是放射生物学研究的主要内容之一。在辐射引起的DNA损伤修复过程中ATM/Chk2/p53通路起重要作用。DNA损伤后ATM立刻被激活,活化Chk2,从而磷酸化p53或直接通过p53传递损伤信号,开启DNA损伤修复进程。随着辐射研究的不断深入,表观遗传学的逐渐兴起,人们发现组蛋白修饰在DNA损伤修复中起重要作用。Valérie Borde等研究发现在IR照射后,SPR-5迅速聚集到DNA双链断裂(DNA doubled-strand breaks,DSBs)区移除H3K4me2,从而招募双链断裂修复(doubled-strand break repair,DSBR)蛋白对DNA损伤进行修复。Sheema Fnu等发现H3K36me2在辐射诱导的DSB中可以通过增强非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)介导的DSB损伤修复。H3K9me3在IR诱导的小鼠胚胎成纤维细胞中会与Tip60在DNA损伤区域相互作用,促使ATM激活,进而触发下游DNA损伤应答(DNAdamage response,DDR)对DSB进行修复。目前H3K27me3在DNA损伤修复中研究较少,Zhiqing Li等人对家蚕在紫外线UV诱导的DNA损伤中发现PRC2介导的H3K27me3增加,并且发现具有PcGs基因缺失的蚕细胞显示出对UV-C辐射的高度敏感性。同时,Shu-Bin Gao等人研究显示通过EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126抑制HepG2细胞的H3K27me3后会促进化疗药物MMC诱导的DNA损伤。以上研究证实了组蛋白甲基化在DNA损伤修复中的重要作用。目的:通过建立干扰EZH2和过表达HepG2细胞模型,证实H3K27me3在辐射诱导DNA损伤中的作用,探讨PcGs家族成员EZH2介导的H3K27me3对ATM/Chk2/p53调控机制。方法:1.通过流式细胞术检测不同处理组HepG2细胞的细胞周期变化。2.通过免疫荧光方法检测不同处理组HepG2细胞γH2AX及H3K27me3的表达。3.通过Real-time PCR方法检测各处理条件下HepG2细胞EZH2、BMI1及ATM、Chk2和p53基因表达水平变化,再通过Western blot方法检测EZH2、H3K27me3、ATM和p53蛋白表达水平变化。4.采用瞬时转染方法建立干扰EZH2和EZH2过表达HepG2细胞模型,观察EZH2与ATM/Chk2/p53通路的调控关系。5.采用免疫共沉淀技术,检测不同处理组HepG2细胞ATM启动子区域H3K27me3的修饰变化。结果:1.电离辐射对HepG2细胞周期、DNA损伤及目的基因转录及蛋白表达水平的影响HepG2细胞进行不同剂量辐射后12h及24h细胞发生G2期阻滞,且呈剂量依赖性升高;各照射组相与假照组比较,γH2AX和H3K27me3焦点数明显增多,DNA损伤及H3K27me3表达呈剂量依赖性升高;辐射组中PcGs家族成员EZH2及BMI-1 mRNA表达水平显著高于对照组,EZH2和H3K27me3蛋白表达水平明显高于对照组;照射后ATM、Chk2及p53基因mRNA表达水平显著高于对照组,同时ATM、p53蛋白表达水平亦明显高于对照组。2.抑制EZH2酶活性后辐射对细胞周期、DNA损伤及目的基因转录及蛋白表达水平的影响对HepG2细胞进行不同剂量的照射后,加入3μmol/L GSK126抑制EZH2酶活性,HepG2细胞发生G2/M期阻滞,呈剂量依赖性升高,而且IR+GSK126组与IR组相比,G2/M期阻滞显著降低;免疫荧光结果显示IR+GSK126组与IR组相比H3K27me3焦点数明显减少,而γH2AX焦点数明显增多;基因表达结果显示IR+GSK126组与IR组相比EZH2 mRNA表达水平显著升高,但H3K27me3蛋白表达水平却显著降低;辐照后6h IR+GSK126组与IR组相比ATM和p53 mRNA表达水平显著升高,Chk2 mRNA表达水平变化不明显;但辐照后12h在8Gy剂量条件下IR+GSK126组与IR组相比ATM、Chk2及p53mRNA表达水平显著降低。3.EZH2干扰和过表达中辐射对ATM、Chk2及p53基因表达的影响免疫荧光结果显示,干扰EZH2后不同照射剂量组中γH2AX的焦点数明显增多,而H3K27me3的焦点数明显减少;基因表达水平结果显示EZH2干扰照射组与单纯照射组比EZH2 mRNA表达水平显著下降,同时H3K27me3蛋白表达水平也下降;EZH2过表达照射组与单纯照射组比,EZH2 mRNA和H3K27me3蛋白表达水平都显著升高;照射后6h EZH2干扰组与单纯照射组比ATM、Chk2、p53 mRNA表达水平显著升高;照射后12h EZH2干扰组与单纯照射组比ATM、p53蛋白表达水平明显升高;EZH2过表达后ATM、Chk2及p53基因在转录及蛋白水平上变化不明显。4.GSK126处理组和EZH2干扰组中ATM启动子区域H3K27me3的修饰变化我们在ATM启动子上游-1630~-774区域及下游719~3475区分别选取3个H3K27me3的结合位点,采用ChIP实验检测H3K27me3的表达变化,发现siEZH2组和GSK126组,ATM启动子区H3K27me3的表达水平显著降低。且在PP4位点上H3K27me3的表达变化最为明显。结论:1.在电离辐射诱导的HepG2细胞DNA损伤反应中ATM/Chk2/P53通路被激活。2.EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126通过降低H3K27me3表达水平促进电离辐射诱导的DNA损伤。3.PcGs家族中关键基因EZH2通过介导ATM启动子区域的H3K27me3参与到DNA损伤修复中。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R818

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本文编号：2663143