Cx43在血管内皮细胞辐射损伤调控中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-22 04:54

【摘要】：背景流行病学研究显示,接受放射治疗的病人或放射事故的幸存者中,心血管疾病的发病率显著增加。血管内皮细胞是介导辐射诱导的心血管疾病的关键细胞。血管内皮细胞的损伤和细胞因子分泌是辐射损伤的主要急性效应,这些现象改变了受照机体的内部环境,使其出现慢性炎症状态,从而导致动脉粥样硬化、纤维化等慢性疾病,严重影响接受放射治疗的病人和放射事故幸存者的预后及生活质量。因此,了解X射线诱导血管内皮细胞损伤的分子机制,对于降低放射治疗的副作用,提高治疗和预后效果,改善放射事故存活者的生活质量具有重要意义。Cx43蛋白是缝隙连接蛋白家族中的成员之一,主要负责细胞间小分子和信号的传递。大量研究表明,Cx43在心血管损伤中发挥重要作用。在肥厚性心肌病、心力衰竭以及缺血性心脏病中,Cx43的表达和分布发生变化;Cx43对血管通透性、内皮细胞分化及血管修复、血流动力学和血管平滑肌细胞增殖及迁移具有调控作用。但Cx43在X射线诱导的血管内皮细胞损伤中的作用及其机制还未见报道。目的本论文旨在探讨Cx43在X射线诱导的人血管内皮细胞损伤中的作用及其机制。分析X射线诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)内Cx43表达、分布和磷酸化的情况以及Cx43在受照细胞增殖、凋亡和焦亡中的作用,并通过研究Cx43与Panxl或钙信号通路之间的关系,探讨Cx43调控细胞焦亡的机制,为X射线辐射损伤防治方法的研究提供新的思路和潜在的作用靶点。方法1、X射线对Cx43表达、分布及磷酸化的影响。采用Western blot以及免疫荧光染色法检测Cx43在HUVEC细胞受到不同剂量(0 Gy、5 Gy、10 Gy和20 Gy)X射线照射后,不同时间(6 h、12 h、24 h、48 h和72 h)的表达、分布以及磷酸化的变化。2、Cx43对受照HUVEC细胞增殖和凋亡的影响。采用siRNA技术对Cx43进行沉默或转染质粒对Cx43进行过表达后,CCK-8以及克隆形成实验分别检测受到10 Gy X射线照射后72 h和受到2.5 Gy X射线照射后14 d细胞存活的情况;采用PI-AnnexinV凋亡试剂盒检测不同剂量(0 Gy、5 Gy、10 Gy和20 Gy)X射线照射后48 h、72 h、96 h HUVEC细胞的凋亡情况。Western blot检测细胞受到不同剂量(0 Gy、5 Gy、10 Gy和20 Gy)X射线照射后72 h凋亡执行分子caspase-3以及Cx43的蛋白表达水平。3、X射线诱导HUVEC细胞焦亡。0～20 Gy X射线照射HUVEC后6～48 h,采用Western blot法检测细胞焦亡执行分子caspase-1的表达及活化情况;10 Gy X射线照射细胞后72 h,采用PI-FLICA染色通过流式细胞术以及激光共聚焦显微镜检测HUVEC细胞焦亡情况;采用透射电子显微镜检测细胞形态变化;采用LDH检测细胞膜破裂及细胞毒性;综合以上指标说明细胞焦亡状态。4、Cx43直接调控受照HUVEC细胞焦亡。采用siRNA技术对Cx43进行沉默以及或转染质粒对Cx43进行过表达后,10 Gy X射线照射细胞后72 h,采用PI-FLICA染色通过流式细胞术以及激光共聚焦显微镜检测HUVEC细胞焦亡情况;采用透射电子显微镜检测细胞形态变化;采用LDH检测细胞膜破裂及细胞毒性;10 Gy X射线照射细胞后12 h,采用Western blot方法检测细胞焦亡执行分子caspase-1的表达及活化情况;综合以上指标说明Cx43对细胞焦亡的调控作用。5、Cx43通过影响Panx1剪切调控受照HUVEC细胞焦亡。采用Western blot检测10 Gy X射线照射后0～72 h以及0～10 Gy X射线照射后12 h细胞中cleaved Panx1的表达水平。siRNA技术对Cx43进行沉默或转染质粒对Cx43进行过表达后,Western blot检测10 Gy X射线照射细胞后12 h cleaved Panx1表达水平。采用siRNA技术对Panx1和Cx43进行沉默,10 Gy X射线照射后72 h采用PI-FLICA染色通过流式细胞术以及激光共聚焦显微镜检测HUVEC细胞焦亡情况;采用透射电子显微镜检测细胞形态变化;采用LDH检测细胞膜破裂及细胞毒性;10 Gy X射线照射细胞后12 h,采用Western blot方法检测细胞焦亡执行分子caspase-1的表达及活化情况;综合以上指标说明Cx43通过影响Panx1调控受照细胞焦亡。6、Cx43通过影响受照HUVEC细胞内钙调控细胞焦亡。采用Fluo-4/AM染色利用流式细胞术以及激光共聚焦显微镜检测受10 Gy X射线照射后0～72 h以及0～20 Gy X射线照射后12 h细胞内钙浓度变化。siRNA技术对Cx43进行沉默或转染质粒对Cx43进行过表达后,采用Fluo-4/AM检测10 Gy X射线照射细胞后12 h细胞内钙变化。采用siRNA技术对Cx43进行沉默的同时,采用钙抑制剂BAPTA/AM、2-APB和Nifedipine分别对细胞内钙进行抑制,采用PI-FLICA染色利用流式细胞术以及激光共聚焦显微镜检测HUVEC细胞焦亡情况;采用透射电子显微镜检测细胞形态变化;采用LDH检测细胞膜破裂及细胞毒性;10 Gy X射线照射细胞后12 h,采用Western blot方法检测细胞焦亡执行分子caspase-1的表达及活化情况;综合以上指标说明Cx43通过影响受照细胞内钙调控细胞焦亡。结果1、X射线照射抑制HUVEC细胞中Cx43的表达,并影响其分布和磷酸化。10 Gy X射线照射后6～72 h,HUVEC细胞中Cx43表达量降低,且在照射后12 h时,Cx43的表达随照射剂量的增加而降低。5 Gy、10 Gy、20 Gy X射线照射后24 h,HUVEC细胞中Cx43分布由细胞间隙转移入核及核周,照射后48 h Cx43的Ser368位点磷酸化水平升高并且随剂量增加而增加。2、Cx43对受照HUVEC细胞增殖和凋亡的影响:(1)Cx43促进受照HUVEC细胞增殖。0～20 Gy X射线照射后72 h,HUVEC细胞存活率随照射剂量增加而降低。10 Gy X射线照射后72 h,Cx43过表达组存活率明显高于空载体组,受到2.5 Gy X射线照射后,HUVEC细胞的14 d存活率有增高趋势;10 Gy X射线照射后72 h,Cx43沉默组的增殖和受到2.5 Gy X射线照射后HUVEC细胞的14 d存活率均明显低于无意序列组(即沉默组的阴性对照组)。(2)Cx43抑制受照HUVEC细胞凋亡。10 Gy X射线照后48～96 h HUVEC细胞凋亡增加并且受照后72 h在0～20 Gy呈现剂量依赖性。0～20 Gy X射线照射72 h后,Cx43表达随剂量增加而降低,cleaved caspase-3表达随剂量增加而增高。Cx43沉默组HUVEC细胞早期凋亡及晚期凋亡细胞比例明显高于无意义序列组;Cx43过表达组HUVEC细胞早期凋亡及晚期凋亡细胞比例明显低于空载体组;Cx43沉默组较无意义序列组cleaved caspase-3表达增强而过表达组低于空载体组。3、X射线诱导HUVEC细胞焦亡。10 Gy X射线照射后6～48 h,cleaved caspase-1表达量增高,在照射后12 h表达量随照射剂量增加而增加;X射线照射后72 h,FLICA染色在10Gy组增强,PI-active caspase-1染色比例增高,细胞出现胀裂死亡形态特征,细胞外液中LDH水平增高。4、Cx43抑制受照HUVEC细胞焦亡。10Gy X射线照射HUVEC细胞后72 h,Cx43过表达组与空载体组相比,焦亡细胞百分率明显降低,FLICA染色降低,细胞外液的LDH水平降低;10 Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,Cx43过表达组与空载体组相比,cleaved caspase-1的表达水平降低。相反,10 Gy X射线照射HUVEC细胞后72h,Cx43沉默组与无意序列组相比,焦亡细胞百分率明显升高,FLICA染色增强,细胞外液的LDH水平升高;10 Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,Cx43沉默组与无意序列组相比,cleaved caspase-1的表达水平增加。5、Cx43通过抑制Panx1剪切降低受照HUVEC细胞焦亡。10 Gy X射线照射HUVEC细胞后12～72 h cleaved Panx1的表达增加,在0～10 Gy照射后12 h呈现随照射剂量增加表达增加的剂量效应关系。10 Gy X射线照射HUVEC细胞后72 h,Panx1沉默组与无意序列组相比,焦亡细胞百分率降低,细胞外液LDH水平降低;10Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,cleaved caspase-1的表达水平降低。10 Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,Cx43过表达后cleaved Panx1降低而Cx43沉默可以增加cleaved Panx1的表达。当同时沉默Panx1和Cx43后,Panx1和Cx43双沉默组与Cx43单独沉默组相比,10 Gy X射线照射HUVEC细胞后72 h,焦亡细胞百分率降低,FLICA染色降低,细胞外液LDH水平降低,10 Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,cleaved caspase-1的表达水平降低。6、Cx43通过抑制受照HUVEC细胞内钙降低细胞焦亡。10 Gy X射线照射HUVEC细胞后0～12 h,细胞内钙明显增加,且在12 h达到最大值,在12 h细胞内钙浓度随照射剂量(0 Gy,2.5 Gy,5 Gy,10 Gy,20 Gy)增加而增加。10Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,Cx43过表达抑制细胞内钙增加,而Cx43沉默可以增加内钙浓度。10Gy X射线照射HUVEC细胞后72 h,使用钙抑制剂BAPTA/AM,2-APB,Nifedipine组与DMSO溶剂对照组相比,有效抑制了细胞内钙增加,同时焦亡细胞百分率明显降低,细胞外液的LDH水平降低;10 Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,钙抑制剂BAPTA/AM,2-APB,Nifedipine与DMSO溶剂对照组相比,cleaved caspase-1的表达水平降低。当同时沉默Cx43以及使用钙抑制剂时,三种钙抑制剂均可以缓解由于Cx43沉默后导致的细胞焦亡增加。10 Gy X射线照射HUVEC细胞后72 h,Cx43沉默+钙抑制剂组与Cx43单独沉默组相比,焦亡细胞百分率降低,细胞外液LDH水平降低;10Gy X射线照射HUVEC细胞后12 h,cleaved caspase-1的表达水平降低。结论1、X射线照射导致HUVEC细胞内Cx43 Ser368位点磷酸化,促进Cx43表达水平降低和分布变化。2、Cx43可促进X射线照射后HUVEC细胞增殖,抑制其凋亡,其调控细胞凋亡的机制与抑制caspase-3的活化有关。3、X射线照射诱导HUVEC细胞焦亡。4、Cx43通过抑制焦亡关键分子caspase-1的活化或Panx1剪切降低受照HUVEC细胞焦亡。5、Cx43通过抑制细胞内钙增加,降低受照细胞焦亡。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R818
【图文】：

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打孔蛋白（Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ）活化，在细胞膜表面形成小孔［１８５］，破坏细胞的离子梯度，导致渗逡逑透压增加，细胞肿胀和破裂，同时，胞质内容物及细胞炎症因子通过孔隙释放至胞外（如逡逑图３所示）。逡逑Ｃａｓｐａｓｅ－１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ逡逑Ｔｏｘｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ逡逑Ｂ．邋ａｎｔｈｒａｃｉｓ逦ＰＡＭＰｓ邋＆邋ＤＡＭＰｓ邋Ｓ．邋Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ逦ｄｓＤＮＡ逦ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ逡逑ｏｆ邋Ｒｈｏ邋ＧＴＰａｓｅｓ逡逑１逦ｉ逦Ｉ逦ｉ逦ｉ逡逑Ｑ邋ＮＬＲＰＩｂ逦ＮＬＲＰ３逦Ｐ邋ＮＬＲＣ４逦＾邋ＡＩＭ２逦＇Ｐｙｒｉｎ逡逑ｇ逦＾逦｜＞ＥＫ７邋ｐ邋ＱＮＡＩＰｓ逡逑Ａ：逦丨N：：逡逑Ｉ逦１逦？邋0邋逦１逦１逡逑Ａｃｔｉｖｅ邋Ｃａｓｐａｓｅ－１逡逑Ｘ逦）！逦Ｌ逡逑厂］逡逑ｉ逦＼逦ｉ逦ｉ逡逑Ｃ＝Ｘ）逦ｏ逡逑Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ邋Ｄ邋Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ逦Ｐｒｏ－ＩＬ－１ｐ邋ＵＰ逡逑Ｐｒｏ－ＩＬ－１８邋ＩＬ１８逡逑Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ逦逦｜逡逑0邋ｏ逡逑ｏ逡逑图３．细胞焦亡分子机制示意图［１８６］逡逑３．３细胞焦亡经典通路相关分子逡逑３．３．１逦ＴＬＲｓ逡逑Ｔｏｌｌ样受体（ＴＬＲｓ）可以识别病原相关分子模式（ＰＡＭＰｓ），位于细胞表面或胞内体，逡逑启动相关信号转导通路，包括转录因子ＮＦ－ｋＢ和ＭＡＰＫｓ通路，这些通路的激活反过来又逡逑导致炎性细胞因子产生，如干扰素ａ／卩、ＴＮＦ和ＩＬ－６［１８７］。逡逑３．３．２逦ＮＬＲｓ逡逑ＮＯＤ样受体（ＮＬＲｓ）含有２０个以上的亚群［１８８］

细胞肿胀,小体,炎症,结构示意图

细胞焦亡过程中炎症小体结构示意图[[193]

示意图,打孔,蛋白,示意图

的非经典通路逡逑ｃａｓｐａｓｅ－１介导的细胞焦亡经典通路外，在细胞受到细菌感染时，细ＰＳ）可以引发细胞发生焦亡的非经典通路。在这一通路传导过程中，Ｌｅ－４／５／ｌｌ，而不需要通过炎症小体介导ｃａｓｐａｓｅ－１的激活；在通路使Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ蛋白剪切，使其对细胞膜的打孔功能激活，最终导致几种死亡类型的区别逡逑可以通过截然不同的生物化学途径，产生不同的形态和生理结果（胞凋亡是目前研究最多的细胞程序性死亡过程，又名Ｉ型细胞程序化的ｃａｓｐａｓｅ家族成员裂解细胞基质完成，典型的细胞凋亡形态包括，ＤＮＡ断裂以及凋亡小体的形成等，形成的凋亡小体，可在体内亡过。这一过途的调：源

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