SNK-SPAR途径介导微波辐射致树突棘可塑性异常的机制研究

发布时间：2020-07-24 07:02

【摘要】：目的和意义:随着微波技术的普及,其在生活、生产以及军事中得到广泛的应用。中枢神经系统被公认为是微波辐射的敏感靶部位之一,流行病学和实验研究均表明,微波辐射可导致脑电异常、睡眠障碍以及认知功能的减退。海马是学习记忆的重要部位,突触可塑性是学习记忆的神经基础,树突棘是构成绝大多数兴奋性突触突触后成分的结构。SNK-SPAR途径在由神经元活化并诱导的突触重构中发挥关键作用。当神经元受到刺激被活化后,SNK与SPAR被磷酸化并发生相互作用,进而发生泛素化,并通过蛋白酶体途径降解,导致PSD-95等突触后脚手架蛋白丢失,最终使树突棘从成熟的钝圆形变成狭长型。已有研究表明,微波辐射可致树突棘可塑性异常,然而其机制鲜有报道,因此,本研究选择以SNK-SPAR途径为切入点,旨在探讨微波辐射导致树突棘可塑性异常的机制,并为微波辐射所导致的脑损伤的防护和治疗提供新的候选靶点。材料和方法:(1)采用参数为频率2.856 GHz,平均功率密度30 mW/cm~2的微波照射Wistar大鼠,对照组与照射组各50只,照射共持续6周,每次6 min,每周3次。采用Morris水迷宫对实验大鼠进行空间学习记忆能力检测,于微波照射后1~5 d进行定位航行实验,于照射后14 d进行空间探索实验;于辐射后6 h、7 d、14 d和28 d,采用高尔基染色法对海马组织神经元树突棘形态和分布进行检测;采用透射电镜对海马组织神经元及树突棘的超微结构改变进行观察;(2)采用Real time rt-PCR检测大鼠海马组织SNK mRNA表达水平的改变;采用Western-blot检测大鼠海马组织SNK、SPAR及PSD-95的蛋白表达改变;采用免疫荧光双标记检测SPAR和PSD-95相互作用程度的变化;(3)采用参数为频率2.856 GHz,平均功率密度30 mW/cm~2的微波辐射大鼠原代海马神经元,共照射3次,每次6 min,每次照射之间间隔6 min;于照射后0 h、6 h、1 d、2 d和3 d,采用CM-DiI染色在激光共聚焦显微镜下观察辐射后神经元树突棘分布和形态的改变;采用HPLC检测氨基酸递质释放情况;采用Real time rt-PCR检测大鼠原代海马神经元SNK mRNA水平的改变;采用Western-blot检测大鼠原代海马神经元SNK-SPAR途径主要分子:SNK、SPAR及PSD-95的蛋白表达改变,SNK-SPAR途径上游分子CaN、CREB、p-CREB和NFATC4、p-NFATC4的表达改变,SNK下游Ras/Rap家族蛋白RasGRF1、RapGEF2和SynGAP表达的变化;采用免疫荧光双标记检测p-CREB在神经元内的定位和表达改变;采用免疫共沉淀及NanoLC MS/MS技术检测照射后SNK和SPAR的磷酸化及泛素化水平的改变;(4)针对以上环节给予SNK抑制剂BI2536,检测SNK及其下游蛋白表达的改变;给予CaN抑制剂FK506,检测SNK mRNA水平、蛋白表达及其转录因子p-CREB表达改变,并同时检测上述干预后神经元树突棘分布及形态的改变。实验结果:(1)微波辐射对大鼠空间学习记忆能力、海马组织树突棘分布以及神经元和树突棘超微结构的影响。(1)学习和记忆能力:在定位航行实验中,照射组大鼠平均逃避潜伏期显著长于对照组(p0.05或p0.01);空间探索实验中,照射组大鼠在目标象限所用时间百分比和穿越平台次数的平均值均显著低于对照组(p0.05);(2)海马组织神经元树突棘分布及形态:大鼠海马组织齿状回区颗粒细胞树突棘密度在照射后6 h、14 d和28 d显著低于对照组(p0.05),锥体细胞内蘑菇型树突棘所占百分比在照射后28 d显著低于对照组(p0.05);(3)大鼠海马组织神经元/树突棘超微结构:照射组可见神经元内质网扩张,线粒体肿胀空化,树突棘微刺内吞,突触后致密物长度及厚度相比对照组显著降低(p0.05或p0.01);(2)微波辐射对大鼠海马组织SNK-SPAR途径相关分子的影响。(1)微波辐射后SNK mRNA水平在各检测时间点均显著上调(p0.01);(2)SNK蛋白表达在照射后6 h降低(p0.01),14 d和28 d时升高(p0.05或p0.01),SPAR蛋白表达在照射后6 h和14 d显著下调(p0.01),PSD-95在照射后28 d显著降低(p0.05);(3)SPAR与PSD-95相互作用程度在照射后6 h和28 d时显著降低(p0.05或p0.01);(3)微波辐射对大鼠原代海马神经元树突棘分布以及SNK-SPAR途径及其上下游分子的影响。(1)微波照射后1d,大鼠原代海马神经元树突棘密度和成熟树突棘百分比均显著低于对照组(p0.05),照后3 d时恢复;谷氨酸递质在照射后6 h和3 d显著低于对照组(p0.01),甘氨酸除照射后6 h外其余各时间点均显著高于对照组(p0.05或p0.01);(2)大鼠原代海马神经元内SNK mRNA在照射后即刻显著降低,在6 h和1 d时显著升高(p0.05);SNK蛋白表达在照射后即刻下降,照射后6 h和1 d升高(p0.05或p0.01);SPAR在照射后0 h~1 d时显著降低(p0.05或p0.01),PSD-95在照射后6 h~1 d显著低于对照组(p0.05或p0.01);(3)SPAR与PSD-95发生特异性结合的GKBD结构域磷酸化位点由照射前的ser-1567和ser-1472转变为照射后的ser-1603;与SNK和SPAR发生相互作用的泛素蛋白B在照射后均发生不同程度的升高;发现微波辐射可引起SPAR与MAP2的相互作用;(4)SNK下游Ras/Rap家族蛋白:微波辐射后0 h~1d,RapGEF2和SynGAP蛋白表达均显著降低,RasGRF1仅在照射后0 h~6 h时显著降低(p0.05或p0.01);(5)SNK上游分子:CaN在照射后0 h~3 d表达均显著降低(p0.05或p0.01),p-CREB在核内高表达并在照射后1 d显著升高(p0.01),p-CREB在微波照射后1 d向神经元核内转位,且较对照组相比表达升高(p0.05),p-NFATC4表达在核内表达量极少,且浆蛋白内p-NFATC4在微波照射前后无显著差异;(4)微波辐射后大鼠原代海马神经元SNK-SPAR途径干预实验。(1)在给予SNK抑制剂BI2536后,照射+BI2536组SNK蛋白表达较对照组及单纯照射组显著降低(p0.05或p0.01),照射+抑制剂组树突棘密度显著高于对照组及单纯照射组(p0.05或p0.01),成熟树突棘所占百分比显著高于单纯照射组(p0.05),与对照组相比无显著差异;(2)在给予CaN抑制剂FK506后,照射+FK506组CaN蛋白表达较单纯照射组显著降低(p0.01)和p-CREB蛋白表达较单纯照射组显著升高(p0.05),SNK mRNA水平显著高于单纯照射组(p0.05),而其蛋白表达与单纯照射组相比无显著差异。结论:30 mW/cm~2微波辐射后:1.大鼠空间学习记忆能力降低;海马神经元树突棘分布发生改变,表现为树突棘微刺内吞,突触后致密物厚度和长度减少,齿状回颗粒细胞树突棘密度减少,CA区锥体细胞成熟树突棘比例降低。2.SNK-SPAR途径相关蛋白表达异常,SNK上调促使SPAR的降解和PSD-95丢失,使树突棘成熟受阻,突触连接弱化,大鼠学习记忆能力下降。3.大鼠原代海马神经元树突棘密度和成熟树突棘所占百分比减少;兴奋性氨基酸递质释放减少。4.大鼠原代海马神经元SNK-SPAR途径稳态破坏:CaN的低表达引起SNK转录因子p-CREB表达升高和核转位,SNK mRNA水平显著上调,SNK蛋白表达升高,SNK和SPAR磷酸化、泛素化水平升高,SNK下游Ras/Rap家族蛋白表达失衡;5.SNK是微波辐射致树突棘可塑性异常的有效作用靶点;6.发现SPAR磷酸化位点改变可能是影响其与PSD-95作用的具体方式;MAP2与SPAR发生相互作用,为微波辐射致树突棘可塑性异常的机制研究提供新思路。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R818
【图文】：

树突棘,几何特征,光学显微镜

差异性激活并导致神经元凋亡和坏死可能是微波辐射致认知功能障碍的重要机制[12]。然而，对于微波辐射致树突棘可塑性异常的机制研究目前尚鲜有报道。SNK-SPAR、Ephrin (Eph family receptor interating protein)/Eph、Neuregulin(NRG)/ErbB以及Wnt信号通路等均在调控树突棘可塑性过程中发挥重要作用。Eph可启动新的突触连接，对处于初期的突触起到恢复和稳定谷氨酸受体的作用还可以调节树突棘的形态；又有研究表明，Ephrins的激活可诱导突触的形成和形态变化，然而在成熟的神经系统中Ephrin可调节突触功能和长时程增强。Neuregulin/ErbB与精神分裂有关（表现为树突棘数量减少），NRG1可增加皮层内锥体细胞树突棘数大小及密度，将ErbB4基因敲除后NRG1对树突棘大小的作用受到抑制，但对其密度的作用未受影响。Wnt在调节成人神经系统的功能和结构和中枢神经系统发育过程中起到关键作用，可控制神经干细胞分化，树突发育，神经元可塑性以及轴突分枝[13-16]。血清诱导激酶( serum inducible kinase，SNK)与树突棘相关的 Rap- 特异性 GTPase- 活化蛋白 (spine-associated Rapguanosinetriphosphatase activating protein，SPAR) 所构成的SNK-SPAR通路在神经元活化后诱导的突触重构中起到关键作用。

示意图,树突棘,途径,钙调磷酸酶

图 2 树突棘内 SNK-SPAR 途径示意图（Wu LX, et al. Brain Res. 2007）钙调磷酸酶(Calcineurin, CaN)，又称钙神经素，可对SNK的基因转录进行调节（图2）。CaN是一种可逆性去磷酸化的关键酶，钙离子内流后，它可能通过

点击,树突棘,鼠标光标,图片

树突棘密度以 10 μm 为单位进行拍摄及分析。采用 Image J 软件分析神经元高尔基染色结果mageJ 是一个基于 Java 的公共的图像处理软件，它能编辑、显示、分析、保存和打印 8 位，16 位和 32 位的图片，支持 TIFF，PNG，GIF，JPEG，DICOM，FITS 等多种格式。1）首先，使用 Photoshop 打开一张拍摄好的高尔基组织切片照片；2）依次点击工具栏上的图像→调整→黑白，调整黄色使之被“过滤”；3）依次点击工具栏上的图像→调整→曲线，拖动曲线至适当的位置，将调节到适合分析的状态，另存图片；4）用 Image J 软件打开图片，首先设置标尺：在图片上画一条与标尺等长，依次点击工具栏上的 Analyze→Set Scale→Known Distance（填上数值）it of length（μm）→勾选 Global→OK；5）依次点击工具栏上的 Plugins→Analyze→Cell Counter（图 1-2）；

【参考文献】