新生鼠脊髓上行联合中间神经元电生理特性、细胞形态及NMDA调节机制的研究

发布时间：2017-04-02 15:15

  本文关键词：新生鼠脊髓上行联合中间神经元电生理特性、细胞形态及NMDA调节机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：行进运动(locomotion)是脊椎动物的基本运动形式,如：行走、游泳、飞翔等。行进运动中控制下肢或后肢运动的神经网络位于脊髓的胸腰段,该神经网络被称为中枢模式发生器(Central Pattern Generator:CPG)。CPG网络中负责协调左右肢体交替运动的中间神经元称为联合中间神经元(commissural interneurons:CINs) [7-9]。CINs是一类将轴突穿过腹侧中线投射向对侧的中间神经元。在对猫和啮齿类动物脊髓的研究中,根据CINs轴突投射方向的不同将其分为短距离投射、上行投射、下行投射和双向投射四类。对这四类CINs在脊髓运动系统中的功能及细胞膜特性有广泛而深入的研究,其中上行投射的联合中间神经元aCINs (ascending commissural interneurons)在之前的研究中证实在由药物引起的虚拟运动中具有节律性兴奋的特性,表明此类联合中间神经元在行进运动中参与了左右肢体的协调与控制。然而,关于aCINs的形态学与其板层(laminae)分布的关联性研究甚少,此外神经递质NMDA对aCINs兴奋性的调节作用目前尚不清楚。鉴此,本研究将对aCINs的形态、分布、细胞膜特性以及NMDA的调节作用进行系统性研究。目的：本研究使用荧光染料通过逆向染色标记法和膜片钳技术对新生大鼠脊髓腰椎的上行联合中间神经元aCINs的形态及其电生理特性进行综合性研究；运用细胞内液荧光染色技术和全细胞测量数据揭示aCINs在脊髓腰椎横截面上的分布及相应细胞膜的电生理特性,为研究aCINs的板层分布、细胞形态及电生理特性之间的关系提供新的研究方法和实验数据；最后,本研究观察神经递质NMDA 对 aCINs兴奋性的调节作用,揭示在虚拟运动中aCINs兴奋性变化所依赖的神经化学机制。方法：本实验采用野生型Wistar大鼠和Balb C小鼠,年龄为出生后1-10天,雌雄均可,动物伦理编号：R20141003。动物斩首后去除内脏,腹侧向上暴露脊柱,将四肢用大头针固定于盛有硅酮树脂的培养皿内,浸入4口氧混合气(95%O2,5%CO2)饱和解剖用人工脑脊液(artificial cerebral spinal fluid:ACSF)。采用椎骨切除术取脊髓置于ACSF中,沿中线自近头端分离至T12节段。(1) aCINs在脊髓腰椎横截面上的分布：逆向染色,切片后在荧光显微镜下观察aCINs在脊髓横截面上的分布情况。(2)电生理实验记录aCINs的基础膜特性：膜片钳技术记录神经元的静息膜电位(Em)、内向电阻(膜电阻Rin)、阈电压(Vth)、基强电流(Rheobase,Ith)、细胞膜电容(Capactiance,Cm)、动作电位高度(AP amplitude)、动作电位半宽(AP half-width).后超极化深度(AHP amplitude)和后超极化半衰时间(AHP 1/2decay)。(3)神经元形态：在电生理实验记录的同时向神经元内注入荧光染料Luciferyellow,使用荧光显微镜观察神经元形态。计算神经元胞体的直径和表面积。(4) NMDA对aCINs兴奋性的影响：在细胞外液NMDA的浓度为10μM时,记录aCINs的静息膜电位(Em)、内向电阻(膜电阻Rin)、阈电压(Vth)、基强电流(Rheobase)、动作电位高度(AP amplitude)、动作电位半宽(AP half-width)、后超极化深度(AHP amplitude)和后超极化半衰时间(AHP 1/2decay)；比较加入NMDA前后条件下aCINs兴奋性的变化。结果：(1) aCINs的胞体多集中在板层Ⅶ (14/37)、Ⅷ (18/37),板层X(5/37)也有少量分布。(2) aCINs神经元的胞体呈现梭形、三角形和多极形,直径(d)为16.2±2,9μm,表面积(Ss)为850.5±326.5μm2.且位于板层Ⅶ(直径：15.8±2.0μm,面积：799.5±202.9μm2)、 Ⅷ (直径：16.5±31μm,面积：882.1±351.5μm2)X(直径：16.2±4.9μm,面积：881.7±326.5gm2)的aCINs在神经元形态上不具备显著的差异性(P0.05)。(3) aCINs的基础膜特性：Em (-60.7±6.5mV)、Rin (1508.1±683.1mΩ)、Vth (-35.6±5.8mV)、Rheobase (13.1±8.3pA)、AP amplitude (51.8±14.5mV)、 AP half-width (2.9±0.7ms)、AHP amplitude (15.0±9.0mV)和 AHP1/2decay (211.0±66.1ms)(4)依据放电特性划的三类aCINs中第一类单峰放电型的神经元与相位放电和持续放电类神经元在基强电流(P0.05)和阂电压(P0.05)方面存在显著差异,而第二类与第三类神经元之间不存在显著性差异。(5)超极化电流可引起24%的aCINs (9/37)产生膜电位的去极化凹(sag),以及超极化电流结束后的膜电位反弹(rebound)。(6) NMDA(10μM)可导致aCINs静息膜电位去极化。(7)NMDA(10μM)降低aCINs的电压阈值和基强电流。结论：(1)三种类型的aCINs在细胞膜电生理特性上显示出差异,但在形态学和脊髓分布上没有差别,说明aCINs神经元在运动过程中也许可以通过其细胞膜特性来提供运动调控机制的多样性,而其形态和分布特性可能不扮演重要的角色。(2)作为兴奋性神经递质的NMDA对行进运动的产生起着至关重要的作用,本文研究的结果表明NMDA可以增强aCINs的兴奋性,说明aCINs在行进运动中具备接受NMDA调控的机制,进而可以发挥协调肢体运动的作用
【关键词】：脊髓 联合中间神经元 基础膜特性 电压阈值 神经递质
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R87
【目录】：

• 论文摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 第一章 研究基础(文献综述)14-24
• 前言14-16
• 第一节 CINs在在脊椎动物体内的分布及形态16-17
• 第二节 CIN的识别方法17-19
• 2.1 逆向染色标记法17
• 2.2 电极检测法17
• 2.3 基因标记技术17-19
• 第三节 CIN的基础膜特性19-21
• 3.1 基础膜特性19-20
• 3.2 神经递质对aCINs的调控作用20-21
• 第四节 aCINs在哺乳动物行进运动中的作用21-23
• 4.1 传统电生理实验确定aCINs在行进运动中的作用21
• 4.2 转基因技术确定aCINs在行进运动中的作用21-23
• 第五节 立项依据23-24
• 第二章 研究报告24-44
• 前言24-25
• 第一节 实验方法25-29
• 实验动物和手术25
• 逆向染色25-26
• 电生理实验26
• 记录神经元的膜特性26-27
• 形态学27
• 统计学分析27-28
• 试剂28-29
• 第二节 实验结果29-41
• 1. aCINs的分布和形态29-30
• 2. aCINs的基础膜特性30-36
• 2.1 aCINs的三种放电类型32-35
• 2.2 aCINs具有超极化电流激活的膜电位凹35-36
• 3. NMDA对aCINs膜特性的影响36-41
• 3.1 NMDA可引起aCINs膜震荡36-37
• 3.2 NMDA增强aCINs的兴奋性37-40
• 3.3 NMDA对内向电阻、sag、以及回弹的影响40-41
• 第三节 结果讨论41-43
• NMDA对aCINs兴奋性的调节41-42
• aCINs的基础膜特性42
• 形态学研究42-43
• 结论43-44
• 第三章 研究总结44-46
• 附录46-47
• 参考文献47-54
• 后记54

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本文编号：282713