原子力显微镜下乙醇作用大鼠海马神经细胞的形态研究

发布时间：2020-10-27 15:24

　　背景与目的:当今社会,饮酒造成的社会问题不断增多,给社会管理带来了极大的压力。许多民事和刑事案件都是由于当事人饮酒过度或者不适时地饮酒引发的,不仅给当事人自身和其家庭带来了伤害,也影响到社会的稳定。在法医学鉴定中,围绕乙醇在伤害或死亡结果中的作用、法律责任的认定等问题容易成为争论的焦点,如何诊断及鉴定也是实践工作中急需解决的难题。因此,做好乙醇对机体相关作用的研究有着重要的意义,它可以从理论上为解决法医学鉴定工作难题提供基础。海马组织是大脑边缘系统的重要组成部分,它一方面具有记忆以及空间定位的作用,另一方面也参与感知觉信息处理、情绪和运动等多种高级神经活动。乙醇作用可能导致海马神经细胞结构异常,影响其正常的生理功能,导致记忆、学习和行为障碍。目前为止,有关乙醇对神经细胞胞体和突起的结构影响、形貌改变等研究较少。本研究利用原子力显微镜高分辨率成像技术对细胞生物学研究的独特优点,观察体外培养的大鼠原代海马神经细胞的形态特征,并研究不同浓度乙醇作用不同时间对细胞形态的影响,进一步探究海马神经细胞的表面结构以及乙醇对神经细胞的损伤机制。方法:对出生24h内的SD大鼠乳鼠进行脑部解剖,分离出大脑海马组织,通过胰酶消化、玻璃管吹打的方式使海马神经细胞分散,然后离心收集细胞进行体外原代培养。分别在细胞生长第1、4、7天取海马神经细胞并标记,4%多聚甲醛固定,用原子力显微镜观察细胞的形态特征和变化,并对相关数据进行收集整理。取第7天培养的状况良好的海马神经细胞随机分成四组,分别为对照组,乙醇低浓度组、中浓度组和高浓度组。在乙醇低、中、高浓度组的培养液中加入适量无水乙醇,使乙醇的终浓度分别为0.5g/L、1.5g/L、3.0g/L。对照组在培养液中加入等量的灭菌PBS溶液。将四个浓度组的细胞再按不同的乙醇作用时间随机分组,依次培养1h、4h、8h、12h,然后使用4%多聚甲醛固定细胞,原子力显微镜进行形态观察,收集图像数据做统计分析。结果:1.在原子力显微镜下,培养第1天的海马神经细胞由原先的圆形或椭圆形逐渐生长为梭形或三角形,胞体上伸出细胞突起。培养第4天,海马神经细胞突起进一步延长并分支,细胞的突起相互接触,初步形成网络结构。此阶段,海马神经细胞胞体表面可看到近似圆形的“孔洞”。培养至第7天,海马神经细胞基本成熟,细胞胞体饱满,轮廓清楚。胞体表面的孔洞直径为1.60μm左右,深度为80~170nm。细胞突起伸长,长度可达胞体的2~3倍。2.乙醇对海马神经细胞的形貌有影响,不同浓度乙醇造成的胞体高度和面粗糙度的改变有差别。低浓度乙醇作用1h、4h、8h时细胞形貌基本与对照组一致,作用12h时神经细胞胞体高度下降,面粗糙度减小。中浓度乙醇作用时,细胞突起发生凹陷,完整性被破坏,细胞胞体有部分塌陷,胞体高度下降,面粗糙度减小。高浓度乙醇作用时,细胞胞体高度下降,面粗糙度减小,中部塌陷严重,细胞轮廓消失,胞体形状不规则。结论:1.海马神经细胞在生长过程中,胞体表面出现近似圆形的孔洞,孔径为1~2μm,深度80~170nm。2.中、高浓度的乙醇对海马神经细胞的形貌有影响,可导致胞体高度下降和面粗糙度减小;神经细胞的胞体和突起的结构被破坏,发生局部塌陷和结构缺失。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：D919
【部分图文】：

海马神经细胞,视野,免疫细胞化学法

果正常海马神经细胞形态观察倒置显微镜下观察养至第 7 天的海马神经细胞经 NSE 免疫细胞化学法染色后，阳性浆和细胞突起呈棕色，胞核呈蓝色。阴性对照组中细胞胞浆和胞随机选取 10 个视野，用软件 Image-Pro Plus 6.0 计算每个视野的阳胞总数的百分比。10 个视野中平均阳性细胞率约为 95%，即原代神经细胞的纯度为 95%。

形貌,海马神经细胞,正常生长,细胞生长