耐辐射菌PprI蛋白的制备及其对小鼠急性辐射损伤作用的研究
发布时间：2021-04-08 05:13
目的:耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）（简称DR）是一种对电离辐射,紫外线,强氧化剂和化学诱变剂具有超强耐受力的极端微生物,是迄今为止地球上发现的抗辐射能力最强的生物之一。最近研究表明,负责这一抗性的开关基因—pprI基因在DNA损伤修复中起着极为重要的作用。pprI基因可作为一个保护开关基因诱导DNA修复基因如recA和pprA的表达,在提高细胞抗氧化能力方面,也可能通过调控过氧化氢酶的表达活性来提高抗H2O2的能力。我们近年的研究表明,pprI基因转染对哺乳动物中子和γ射线急性放射损伤具有显著的防治作用。然而,基因转染用于放射损伤的防治存在一定的困难和局限性。因此,本课题进一步研究pprI基因原核表达系统的构建、PprI蛋白的表达及其纯化,并将其注入受照小鼠体内,研究PprI蛋白对小鼠γ射线急性放射损伤的防治作用。耐辐射球菌pprI基因表达的PprI原核蛋白对真核生物的抗放作用,迄今尚未见国内外文献报道。材料与方法:以我们已获得国家发明专利的pCMV-HA-pprI质粒为模板,构建重组原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并转化入E. coli ...
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PprI基因PCR产物电泳图
图 2. PprI 基因煮菌验证电泳图注：1~14：煮菌验证产物2.重组原核表达质粒的测序鉴定选取初步鉴定显示阳性结果的质粒送测序，测序结果与 NCBI 公布的 pprI 基因碱基序列进行比对，显示二者碱基序列完全一致。三、表达产物的鉴定图 3 SDS-PAGE 结果显示，转化后的大肠杆菌经 IPTG 诱导后，菌体总蛋白在37KD 处有一条新带，而未经 IPTG 诱导的菌中未发现此带。同时，SDS-PAGE 结果显示不同诱导浓度、温度和时间在相对分子量为 37KD 处见到特异性的 PprI 蛋白条带具有一定的差异，IPTG2mmol/L 较 1 mmol/L 诱导后目的蛋白条带增粗，IPTG 诱导 6h 较 4h 后目的蛋白条带增粗，37℃诱导较 25℃诱导后蛋白条带增粗。
图 3 表达产物的 SDS-PAGE 分析（考马斯亮蓝染色）注：1~3: IPTG2mmol/L，25℃分别诱导 0，4，6h ；4~6: IPTG1mmol/L，25℃分别诱导 0，4，6h；7~9: IPTG2mmol/L，37℃分别诱导 0，4，6h ；10~12: IPTG1mmol/L，37℃分别诱导 0，4，6h四、纯化融合蛋白的 Western blotting 鉴定Western blotting 分析表明，含有 His-PprI 融合蛋白的 2、3、4、6、7 可与 His抗体发生特异性反应，见图 4。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗辐射球菌pprI基因活体电转染对受照小鼠睾丸病理学作用的研究[J]. 连利霞,陈婷婷,张永芹,王秀珍,杨占山. 辐射研究与辐射工艺学报. 2011(01)
[2]抗辐射球菌pprI基因活体电转染救治小鼠γ射线损伤的实验研究[J]. 陈婷婷,连利霞,牟英,杨占山. 辐射研究与辐射工艺学报. 2010(03)
[3]细胞因子融合蛋白技术及其应用前景[J]. 房永祥,冯海燕,莫斯科,景志忠. 细胞与分子免疫学杂志. 2009(09)
[4]包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展[J]. 王增,马会勤,张文,陈尚武. 中国生物工程杂志. 2009(07)
[5]人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达[J]. 刘荣,姜文国,刘芳,张砚君,范冬梅,杨铭,熊冬生,杨纯正. 细胞与分子免疫学杂志. 2008(06)
[6]抗辐射菌中DNA损伤修复主要基因群的研究进展[J]. 施美星,屠振力. 激光生物学报. 2007(03)
[7]人NKp44基因克隆及其在大肠埃希菌中的表达和纯化[J]. 高新谱,刘正敏,王来城,焦玉莲,刘义庆,张雪,赵跃然. 中华肿瘤防治杂志. 2007(10)
[8]PprI和RecX蛋白对耐辐射奇球菌抗氧化作用的影响[J]. 田兵,张韶文,许镇坚,盛多红,华跃进,高冠军. 微生物学报. 2006(02)
[9]耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立[J]. 高冠军,陆辉明,黄丽芬,华跃进. 科学通报. 2005(03)
[10]耐辐射球菌pprI突变株的蛋白质组学分析[J]. 郑智国,张春潮,华跃进. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2005(01)
博士论文
[1]三组治疗艾滋病的靶向融合蛋白的基因工程研究[D]. 杨晶.中国协和医科大学 2004
本文编号：3124918
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PprI基因PCR产物电泳图
图 2. PprI 基因煮菌验证电泳图注：1~14：煮菌验证产物2.重组原核表达质粒的测序鉴定选取初步鉴定显示阳性结果的质粒送测序，测序结果与 NCBI 公布的 pprI 基因碱基序列进行比对，显示二者碱基序列完全一致。三、表达产物的鉴定图 3 SDS-PAGE 结果显示，转化后的大肠杆菌经 IPTG 诱导后，菌体总蛋白在37KD 处有一条新带，而未经 IPTG 诱导的菌中未发现此带。同时，SDS-PAGE 结果显示不同诱导浓度、温度和时间在相对分子量为 37KD 处见到特异性的 PprI 蛋白条带具有一定的差异，IPTG2mmol/L 较 1 mmol/L 诱导后目的蛋白条带增粗，IPTG 诱导 6h 较 4h 后目的蛋白条带增粗，37℃诱导较 25℃诱导后蛋白条带增粗。
图 3 表达产物的 SDS-PAGE 分析（考马斯亮蓝染色）注：1~3: IPTG2mmol/L，25℃分别诱导 0，4，6h ；4~6: IPTG1mmol/L，25℃分别诱导 0，4，6h；7~9: IPTG2mmol/L，37℃分别诱导 0，4，6h ；10~12: IPTG1mmol/L，37℃分别诱导 0，4，6h四、纯化融合蛋白的 Western blotting 鉴定Western blotting 分析表明，含有 His-PprI 融合蛋白的 2、3、4、6、7 可与 His抗体发生特异性反应，见图 4。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗辐射球菌pprI基因活体电转染对受照小鼠睾丸病理学作用的研究[J]. 连利霞,陈婷婷,张永芹,王秀珍,杨占山. 辐射研究与辐射工艺学报. 2011(01)
[2]抗辐射球菌pprI基因活体电转染救治小鼠γ射线损伤的实验研究[J]. 陈婷婷,连利霞,牟英,杨占山. 辐射研究与辐射工艺学报. 2010(03)
[3]细胞因子融合蛋白技术及其应用前景[J]. 房永祥,冯海燕,莫斯科,景志忠. 细胞与分子免疫学杂志. 2009(09)
[4]包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展[J]. 王增,马会勤,张文,陈尚武. 中国生物工程杂志. 2009(07)
[5]人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达[J]. 刘荣,姜文国,刘芳,张砚君,范冬梅,杨铭,熊冬生,杨纯正. 细胞与分子免疫学杂志. 2008(06)
[6]抗辐射菌中DNA损伤修复主要基因群的研究进展[J]. 施美星,屠振力. 激光生物学报. 2007(03)
[7]人NKp44基因克隆及其在大肠埃希菌中的表达和纯化[J]. 高新谱,刘正敏,王来城,焦玉莲,刘义庆,张雪,赵跃然. 中华肿瘤防治杂志. 2007(10)
[8]PprI和RecX蛋白对耐辐射奇球菌抗氧化作用的影响[J]. 田兵,张韶文,许镇坚,盛多红,华跃进,高冠军. 微生物学报. 2006(02)
[9]耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立[J]. 高冠军,陆辉明,黄丽芬,华跃进. 科学通报. 2005(03)
[10]耐辐射球菌pprI突变株的蛋白质组学分析[J]. 郑智国,张春潮,华跃进. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2005(01)
博士论文
[1]三组治疗艾滋病的靶向融合蛋白的基因工程研究[D]. 杨晶.中国协和医科大学 2004
本文编号：3124918
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yundongyixue/3124918.html
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