蜕皮甾酮干预大鼠损伤软骨细胞的实验研究
发布时间：2021-07-24 23:24
目的探讨蜕皮甾酮（Ecdysterone,EDS）对损伤软骨细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法1.手术分离SD大鼠膝关节股骨下端关节面软骨组织。2.采用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶共同消化法获取原代细胞。3.采用形态学观察、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色的方法鉴定细胞。4.采用细胞划伤的方法构建损伤软骨细胞模型,模拟软骨损伤的生物学变化。5.筛选EDS作用于损伤软骨细胞的最适药物浓度,并将该浓度用于后续实验。6.通过MTT法检测各组细胞的增殖活力,研究EDS对损伤软骨细胞增殖的影响。7.通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,研究EDS对损伤软骨细胞凋亡的影响。结果1.本实验成功获取了活性和纯度均较高的原代软骨细胞。2.EDS干预损伤软骨细胞的最适药物浓度为3μmol/L。3.与对照组相比,损伤组细胞的增殖活力明显下降（P<0.05）;与损伤组相比,EDS干预组细胞的增殖活力明显升高（P<0.05）;EDS干预组和对照组相比,细胞的增殖活力无显著性差异（P>0.05）。4.与对照组相比,损伤组细胞的凋亡率明显升高（P<0.05）;与损伤组相比,...
【文章来源】：河南师范大学河南省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
实验技术路线图
3.5 实验方法由于本课题研究主要是围绕细胞实验展开，因而在实验过程中尤其是在进行单纯的细胞实验时必须严格要求在无菌的条件下完成；为更好的确保实验在进行过程中的无菌环境，实验时需要完成以下一些基本的操作：实验于开始前务必穿戴专用工作服、一次性无菌乳胶手套和一次性口罩等；超净工作台在使用之前需要打开工作台内的紫外灯进行 30min 的紫外照射；超净工作台使用结束之后清理废液缸并用无菌的 75%医用酒精全面擦拭超净工作台的台面 2 - 3 遍才可以将超净工作台关闭；进入细胞间后，应用 75%医用酒精喷壶适量喷洒自己的工作服和手套；每两周必须对细胞间进行一次常规性的消毒；观察细胞培养箱内是否污染，定期更换细胞培养箱下托盘里的无菌超纯水，对整个细胞培养箱进行 90℃高温灭菌。下图为本研究实验环境及部分灭菌操作（图 3-2）。
具体操作步骤如下。1) 将细胞培养瓶放于超净工作台内，用无菌吸管吸取原来的细胞培养液，之后向培养瓶内加入 5ml 无菌的 PBS 磷酸缓冲液洗涤 3 遍。2) 弃去洗涤液并用加入 500μl 的 0.25%胰蛋白酶溶液，待绝大多数细胞的细胞形态由多角形逐渐变为近圆形且有部分细胞渐渐处于非贴壁状态时；迅速向培养瓶内加入3-5 ml 新鲜的低糖 DMEM 完全培养液，用以终止细胞的消化，完成后用移液枪轻轻反复的吹打培养瓶内细胞混合液，直至混合液基本形成单细胞悬液的状态。3) 将得到的单细胞悬液按照体积为 1:2 或 1:3 的比例将其传代至新的 25cm2细胞培养瓶，并且用低糖 DMEM 完全培养液将每个细胞培养瓶的液体补充至 5ml 左右；于细胞培养箱内进行常规的培养（原培养瓶可继续使用，但使用时间不宜超过一个月）。综上可知，细胞达到一定融合程度（图 3-3A）时需要进行消化处理；细胞在消化过程中会出现从瓶底逐渐脱落并在悬浮液中游走的现象（图 3-3B、图 3-3C）；消化完成后基本所有的细胞从培养瓶壁上完全脱落，悬浮的细胞形态呈圆形（图 3-3D）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]内质网应激介导蜕皮甾酮对H2O2诱导的心肌细胞损伤的保护作用[J]. 郭长磊,吕风华,王国戗. 中国免疫学杂志. 2017(11)
[2]蜕皮甾酮对UVB诱导HaCaT细胞损伤的保护作用[J]. 胡惠清,刘斌,李静. 中国皮肤性病学杂志. 2017(07)
[3]定向结构软骨支架材料修复运动性关节软骨损伤[J]. 赵霞,郭秋林. 中国组织工程研究. 2017(02)
[4]20-羟基蜕皮甾酮对脓毒症小鼠心肌诱导型一氧化氮合酶表达的抑制[J]. 夏西超,刘庆春,王海鑫,张东献,归改霞,张东,刘荣志. 中华老年心脑血管病杂志. 2015(08)
[5]补肾活血方中4种有效成分对炎性因子释放抑制活性研究[J]. 孙东东,沈卫星,王卓,晏婷婷,程海波. 中华中医药杂志. 2015(08)
[6]人骨关节炎软骨细胞的体外培养及细胞形态学分析[J]. 唐新,郑果,黄强,李棋,付维力,李箭,陈刚,周宗科,裴福兴. 实用骨科杂志. 2015(07)
[7]彭力平教授论治膝骨痹学术经验[J]. 杨洪杰. 甘肃中医学院学报. 2015(03)
[8]日本大耳兔关节软骨细胞的分离培养及鉴定[J]. 耿书国,王丽丽,汪建样,施剑明,殷嫦嫦. 九江学院学报(自然科学版). 2015(02)
[9]兔软骨细胞的体外分离、培养及鉴定[J]. 王林林,董玉珍. 新乡医学院学报. 2015(04)
[10]Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞[J]. 闫虎,苏友新,林学义,陈宝军,周必洪,张庆. 中国组织工程研究. 2013(50)
博士论文
[1]生物活性材料促进关节软骨损伤修复和再生研究[D]. 张薇.浙江大学 2015
[2]川芎嗪治疗膝骨性关节炎的临床观察及对兔关节软骨细胞增殖与凋亡的影响[D]. 洪昆达.福建中医药大学 2013
硕士论文
[1]牛膝提取物—蜕皮甾酮对脂多糖诱导兔软骨细胞损伤的保护作用[D]. 王刚涛.新乡医学院 2015
[2]凋亡与增殖相关基因在损伤兔关节软骨细胞中的表达变化[D]. 马子君.蚌埠医学院 2014
本文编号：3301640
【文章来源】：河南师范大学河南省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
实验技术路线图
3.5 实验方法由于本课题研究主要是围绕细胞实验展开，因而在实验过程中尤其是在进行单纯的细胞实验时必须严格要求在无菌的条件下完成；为更好的确保实验在进行过程中的无菌环境，实验时需要完成以下一些基本的操作：实验于开始前务必穿戴专用工作服、一次性无菌乳胶手套和一次性口罩等；超净工作台在使用之前需要打开工作台内的紫外灯进行 30min 的紫外照射；超净工作台使用结束之后清理废液缸并用无菌的 75%医用酒精全面擦拭超净工作台的台面 2 - 3 遍才可以将超净工作台关闭；进入细胞间后，应用 75%医用酒精喷壶适量喷洒自己的工作服和手套；每两周必须对细胞间进行一次常规性的消毒；观察细胞培养箱内是否污染，定期更换细胞培养箱下托盘里的无菌超纯水，对整个细胞培养箱进行 90℃高温灭菌。下图为本研究实验环境及部分灭菌操作（图 3-2）。
具体操作步骤如下。1) 将细胞培养瓶放于超净工作台内，用无菌吸管吸取原来的细胞培养液，之后向培养瓶内加入 5ml 无菌的 PBS 磷酸缓冲液洗涤 3 遍。2) 弃去洗涤液并用加入 500μl 的 0.25%胰蛋白酶溶液，待绝大多数细胞的细胞形态由多角形逐渐变为近圆形且有部分细胞渐渐处于非贴壁状态时；迅速向培养瓶内加入3-5 ml 新鲜的低糖 DMEM 完全培养液，用以终止细胞的消化，完成后用移液枪轻轻反复的吹打培养瓶内细胞混合液，直至混合液基本形成单细胞悬液的状态。3) 将得到的单细胞悬液按照体积为 1:2 或 1:3 的比例将其传代至新的 25cm2细胞培养瓶，并且用低糖 DMEM 完全培养液将每个细胞培养瓶的液体补充至 5ml 左右；于细胞培养箱内进行常规的培养（原培养瓶可继续使用，但使用时间不宜超过一个月）。综上可知，细胞达到一定融合程度（图 3-3A）时需要进行消化处理；细胞在消化过程中会出现从瓶底逐渐脱落并在悬浮液中游走的现象（图 3-3B、图 3-3C）；消化完成后基本所有的细胞从培养瓶壁上完全脱落，悬浮的细胞形态呈圆形（图 3-3D）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]内质网应激介导蜕皮甾酮对H2O2诱导的心肌细胞损伤的保护作用[J]. 郭长磊,吕风华,王国戗. 中国免疫学杂志. 2017(11)
[2]蜕皮甾酮对UVB诱导HaCaT细胞损伤的保护作用[J]. 胡惠清,刘斌,李静. 中国皮肤性病学杂志. 2017(07)
[3]定向结构软骨支架材料修复运动性关节软骨损伤[J]. 赵霞,郭秋林. 中国组织工程研究. 2017(02)
[4]20-羟基蜕皮甾酮对脓毒症小鼠心肌诱导型一氧化氮合酶表达的抑制[J]. 夏西超,刘庆春,王海鑫,张东献,归改霞,张东,刘荣志. 中华老年心脑血管病杂志. 2015(08)
[5]补肾活血方中4种有效成分对炎性因子释放抑制活性研究[J]. 孙东东,沈卫星,王卓,晏婷婷,程海波. 中华中医药杂志. 2015(08)
[6]人骨关节炎软骨细胞的体外培养及细胞形态学分析[J]. 唐新,郑果,黄强,李棋,付维力,李箭,陈刚,周宗科,裴福兴. 实用骨科杂志. 2015(07)
[7]彭力平教授论治膝骨痹学术经验[J]. 杨洪杰. 甘肃中医学院学报. 2015(03)
[8]日本大耳兔关节软骨细胞的分离培养及鉴定[J]. 耿书国,王丽丽,汪建样,施剑明,殷嫦嫦. 九江学院学报(自然科学版). 2015(02)
[9]兔软骨细胞的体外分离、培养及鉴定[J]. 王林林,董玉珍. 新乡医学院学报. 2015(04)
[10]Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞[J]. 闫虎,苏友新,林学义,陈宝军,周必洪,张庆. 中国组织工程研究. 2013(50)
博士论文
[1]生物活性材料促进关节软骨损伤修复和再生研究[D]. 张薇.浙江大学 2015
[2]川芎嗪治疗膝骨性关节炎的临床观察及对兔关节软骨细胞增殖与凋亡的影响[D]. 洪昆达.福建中医药大学 2013
硕士论文
[1]牛膝提取物—蜕皮甾酮对脂多糖诱导兔软骨细胞损伤的保护作用[D]. 王刚涛.新乡医学院 2015
[2]凋亡与增殖相关基因在损伤兔关节软骨细胞中的表达变化[D]. 马子君.蚌埠医学院 2014
本文编号：3301640
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